急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由感染、创伤等一种或多种原因导致的全身炎症反应综合征的肺部表现，死亡率高达30%~50%，主要病理特征是广泛肺血管内皮细胞的破坏及炎症细胞浸润[1, 2]。随着干细胞移植在缺血性疾病、心血管疾病和肿瘤防治研究中的应用[3, 4, 5]，近年来发现成血管干细胞——内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)能归巢到损伤的肺组织，参与损伤血管的修复，对急性肺损伤有一定的治疗作用[6, 7]，但对于EPC移植缓解肺损伤的具体抗炎作用目前仍不清楚。本研究主要通过检测各组血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及肺组织中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloper-oxidase,MPO)的表达，来观察EPC移植后对急性损伤肺组织炎症状态的影响，从而进一步探讨EPC移植对损伤肺组织的抗炎作用。
1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂健康同遗传背景的清洁级SD大鼠60只，体质量约150 g，用于EPC的采集；清洁级成年SD大鼠36只，体质量250～300 g，按随机数字表法分为3组(n=12)：PBS组、LPS组、EPC组。动物由第三军医大学实验动物中心提供，实验中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要试剂：淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)、TNF-а、IL-1β及NE的ELISA试剂盒(TaKaRa公司)、髓过氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程公司)。
1.2 EPC的分离、培养及鉴定 1.3 动物分组及EPC移植大鼠经1%戊巴比妥5 mg/kg腹腔麻醉后经尾静脉注入脂多糖(5 mg/kg)诱发ALI；ALI造模30 min后，取培养第10天的EPC，胰酶消化后用无菌PBS稀释悬液(2×106/0.5 mL)经大鼠尾静脉注入PBS组和EPC组，而LPS组同法给予等量的PBS。7 d后经颈动脉取血，4 ℃、3 000 r/min离心5min,取上清保存备用；取部分大鼠肺组织置于-70 ℃保存备用，取部分肺组织处理后行HE染色，余下肺组织称湿质量后，放入75 ℃烤箱烘烤48 h后称干质量，计算湿/干质量比(W/D)。
1.4 肺组织形态学观察及肺损伤评分取大鼠肺组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片5 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察肺组织形态变化；根据Bustos等[3]方法进行肺损伤指数评分。
1.5 血清中TNF-α和IL-1β检测均采用双抗体夹心ELISA法检测，具体步骤按说明书操作。
1.6 肺组织中NE、MPO测定肺组织在玻璃匀浆器中匀浆，分别采用ELISA试剂盒和髓过氧化物酶试剂盒来检测NE和MPO，具体步骤按试剂盒说明书操作。
1.7 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件，计量数据以x±s表示，2组间比较采用配对t检验。
2 结果 2.1 肺组织形态学观察、肺损伤评分及W/D比值HE染色可见PBS组肺组织结构完整；LPS组肺泡结构严重破坏、肺泡腔及肺间质出血、间质增生、大量炎性细胞浸润；EPC组中大部分肺泡结构基本完整，肺组织出血及炎症细胞浸润显著减少。给予LPS后，显著加重了肺损伤，与PBS组比较，肺损伤评分增加(12.25±1.14 vs 1.83±0.58,P<0.01)；同时也使肺泡-毛细 胞管通透性增加，使肺组织含水量增加，其肺组织W/D比值为5.48±0.11 vs 2.68±0.06,差异具有统计学意义(P<0.05)； EPC组与LPS组相比，肺损伤评分较LPS组显著降低(7.17±0.94 vs 12.25±1.14,P<0.05)，肺组织含水量下降，其W/D比值为4.20±0.08 vs 5.48±0.11,差异具有统计学意义(P<0.05，图 1)。
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| A: PBS组； B: LPS组； C: EPC组图 1 各组大鼠肺组织HE染色观察 (×200) |
给予LPS损伤后，血清中TNF-α、IL-1β的含量较PBS组明显增加，组间差异有统计学意义(P<0.05)；EPC移植后降低了TNF-α、IL-1β的含量，与LPS组相比差异有统计学意义(P<0.05，表 1)。
| (pg/mL, n=12, x±s) | ||
| 组别 | TNF-α | IL-1β |
| PBS组 | 39.40±2.11 | 49.18±2.52 |
| LPS组 | 195.88±10.08a | 143.33±10.19a |
| EPC组 | 103.52±10.07b | 78.04±3.98b |
| a：P<0.05，与PBS组比较; b：P<0.05，与LPS组比较 | ||
LPS组中NE、MPO的含量较PBS组显著增加(P<0.05)；但EPC移植后显著降低了NE及MPO的含量，组间差异有统计学意义(P<0.05，表 2)。
| (n=12, x±s) | ||
| 组别 | NE(ng/mL) | MPO(U/g) |
| PBS组 | 0.65±0.03 | 1.32±0.09 |
| LPS组 | 3.88±0.02a | 7.11±0.41a |
| EPC组 | 1.98±0.05b | 4.63±0.37b |
| a：P<0.05，与PBS组比较; b：P<0.05，与LPS组比较 | ||
ALI是指各种原因引起的肺内过度或失控性炎症反应导致的肺泡上皮、肺微血管内皮和肺间质的急性弥漫性损伤。其中，中性粒细胞(polymorphonuclear cells,PMN)在肺内过度聚集和活化发挥了重要作用[9]。在肺内和循环系统各种炎性刺激下，PMN首先聚集、黏附于肺微血管内皮并被激活，由肺血管进入肺组织并持续活化，释放一系列损伤介质(如TNF-α、IL-1β、氧自由基、蛋白酶、脂质代谢产物和肽类物质等)，引起弥漫性肺泡损害，最终导致ALI。EPC是来源于骨髓的原始干细胞，在缺氧、缺血、炎症、外伤等因素刺激下，能直接参与及发挥旁分泌作用，促进损伤血管的修复及微血管新生，EPC移植被认为是血管性疾病最有前景的治疗措施之一[10, 11]。近年来，人们将EPC研究引入肺部疾病领域，在ALI/ARDS中也见报道。研究发现EPC移植后能归巢到损伤的肺组织，参与损伤血管的修复，缓解肺组织损伤[6, 7, 12]。尽管其免疫调节机制目前仍不清楚，但EPC在炎症疾病的治疗应用仍值得研究。在本实验中，我们通过观察EPC移植后肺血清及组织中TNF-а、IL-1β、NE及MPO含量的变化，进一步探讨EPC移植后对损伤肺组织的抗炎作用。
HE染色结果显示：给予LPS后加重了肺损伤，肺泡结构严重破坏、肺泡腔及肺间质出血、间质增生、大量炎性细胞浸润，肺泡-毛细血管膜通透性增加，肺损伤评分及肺组织W/D比值较PBS组显著增加；而EPC移植缓解了肺损伤，EPC组中肺泡结构大部分基本完整，肺组织出血及炎症细胞浸润显著减少，肺W/D 比值及肺损伤评分较LPS组降低，组间差异有统计学意义。
TNF-α主要由PMN、巨噬细胞分泌，被认为是全身炎症反应的始动介质；IL-1β可促进PMN炎症介质的释放，并能与TNF-α产生协同作用，是导致感染及脓毒症发生的重要炎症介质[13, 14]。我们采用ELISA法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量，结果显示：给予LPS刺激后显著增加了TNF-α、IL-1β的含量，与PBS组间差异具有统计学意义；EPC移植后血清中TNF-α、IL-1β的含量较LPS组显著下降。我们还检测了肺组织中NE、MPO的含量，NE由PMN所分泌，能分解几乎所有细胞外基质和许多重要的血浆蛋白，被认为是最具破坏力的酶类之一，同时也被认为是引起ALI/ARDS炎症级联反应的重要炎性损伤因子[15]；MPO是PMN的标志酶，其活性高低反映组织中PMN聚集程度[16]。实验发现LPS组中NE、MPO的含量较PBS组显著增加；但EPC移植后降低了NE及MPO的含量，组间差异有统计学意义。
本研究结果提示：EPC参与损伤肺血管的修复，维持肺泡-毛细血管膜结构稳定、使其通透性降低，肺组织的W/D比值下降；减少了肺间质出血、间质增生及炎性细胞浸润，MPO的降低也反映了PMN在肺组织中的聚集减少，肺损伤评分值下降；同时减少了炎症介质TNF-α、IL-1β及蛋白酶NE的释放，降低了促炎症介质的瀑布样级联放大效应，减少了肺组织基膜胶原的降解，此可能为EPC移植后具有抗炎作用、缓解肺损伤的重要机制之一。
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