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siRNA干扰IRX2对骨肉瘤细胞增殖的影响及其机制
史继德 , 李宏维, 周斌, 王颢, 张海鸿    
730000 兰州,兰州大学第二医院骨三科
摘要目的 探讨易洛魁族同源盒2(iroquois homebox 2, IRX2) 基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对细胞增殖和细胞周期的影响。 方法 体外培养骨肉瘤细胞系,应用RT-PCR和Western blot检测各细胞系中IRX2表达;IRX2-siRNA干扰IRX2的表达后,分别用MTT和流式细胞仪检测MG-63细胞的增殖和周期;Western blot检测JAK3和STAT5活化水平。 结果 IRX2在骨肉瘤细胞系中的表达显著高于人成骨细胞系(P<0.05);沉默IRX2的表达可显著抑制骨肉瘤细胞系MG-63的增殖,促使其S期细胞比例 [(23.93±1.92)%]较对照组 [(15.84±1.76)%]增加(P<0.05),而G2/M期细胞比例[(10.44± 1.99)%]较对照组[(23.14±3.19)%]降低(P<0.05)。IRX2-siRNA可下调p-JAK3和p-STAT5 水平(P<0.05),而过表达IRX2可上调p-JAK3 和p-STAT5水平,并促进MG-63细胞增殖(P<0.05)。在JAK3和STAT5抑制剂的作用下,过表达IRX2对MG-63细胞的促增殖作用显著减弱。 结论 IRX2可部分通过JAK3/STAT5信号通路调控骨肉瘤细胞的增殖。
关键词骨肉瘤     siRNA干扰     细胞增殖     细胞周期     易洛魁族同源盒2基因    
Effect of IRX2-siRNA interference on cell proliferation in human osteosarcoma and related mechanism
Shi Jide, Li Hongwei, Zhou Bin, Wang Hao, Zhang Haihong     
Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou, Gansu Province, 730000, China
Supported by the Project of Innovative Team of Gansu Provincial Department of Science and Technology(2013GS10047) and the Natural Science Foundation of Gansu Provincial Department of Science and Technology(1208RJZA272).
Corresponding author: Zhang Haihong,E-mail:aienlifz@163.com
Abstract: Objective To investigate the expression of iroquois homebox 2 (IRX2) gene and its effect on cell proliferation and cell cycle in human osteosarcoma. Methods RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of IRX2 in MG-63 osteosarcoma cell line. IRX2-siRNA was used to interfere with the expression of IRX2 gene, and the cell proliferation and cell cycle were estimated by MTT assay and flow cytometry. The activation of JAK3 and STAT5 was tested by Western blotting. Results The expression level of IRX2 was significantly higher in the osteosarcoma cell line than in human osteoblast cell line. IRX2-siRNA-induced IRX2 silencing could markedly inhibit the cell proliferation, significantly elevate the cell percentage in S phase [(23.93±1.92)%] compared with the control [(15.84±1.76)%], and significantly reduce the cell percentage in G2/M phase [(10.44±1.99)%] compared with the control [(23.14±3.19)%]. IRX2-siRNA remarkably down-regulated p-JAK3 and p-STAT5, while IRX2 overexpression up-regulated p-JAK3 and p-STAT5 and promoted the proliferation of MG-63 cells. With the inhibitors of JAK3 and STAT5, the cell proliferation promoting effect of IRX2 was attenuated. Conclusion IRX2 can regulate the cell proliferation of osteosarcoma partly by JAK3/STAT5 signaling pathway.
Key words: osteosarcoma     siRNA interference     cell proliferation     cell cycle     IRX2 gene    

骨肉瘤具有很高的局部浸润和早期转移趋势,转移性骨肉瘤5年生存率仅为10%~20%[1, 2]。因此,寻找新的治疗靶点是骨肉瘤临床治疗的迫切需求。有研究发现易洛魁族同源盒2(iroquois homebox 2,IRX2) 基因的表达与部分肿瘤的发展有关[3, 4]。IRX主要编码TALE超家族蛋白含高度保守同源盒序列的同源蛋白,包括IRX1~6六个家族成员[5]。本研究拟通过siRNA的干扰分析IRX2对骨肉瘤细胞增殖和周期的调节作用和相关机制。

1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂

人骨肉瘤细胞系MG-63、OS732、U-20S、HOS、SAOS-2及人成骨细胞系Hfob1.19均购自美国ATCC,MTT、DMSO、青霉素和链霉素(Sigma公司),SYBR® Premix Ex TaqTM 试剂盒(TaKaRa公司),TRIzol、Lipofectamine 2000、pcDNA3.1(Invitrogen公司),硝酸纤维素膜(BioTEKE公司),兔抗IRX2(Aviva System Biology公司),兔抗p-JAK3、兔抗JAK3、兔抗STAT5和p-STAT5及辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)。

1.2 细胞培养

将人骨肉瘤细胞系MG-63、OS732、U-20S、HOS、SAOS-2及人成骨细胞系Hfob1.19置于含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基、37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养。

1.3 RT-PCR检测

TRIzol提取细胞中总RNA并测定其浓度和纯度后,用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA,转录的cDNA置于-20 ℃储存备用。RT-PCR操作步骤参照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行。RT-PCR反应体系为20 μL体系:2 μL cDNA,上下游引物各0.4 μL,SYBR®Premix Ex Taq 10 μL,灭菌蒸馏水7.2 μL。RT-PCR反应程序为:94 ℃预热2 min;94 ℃ 变性20 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s共40个循环。以β-actin为阴性对照。IRX2上游引物[6]:5′-ACGCACACCACCGGAATG-3′,下游引物:5′-ATGGATAGGCCGCACTGC-3′,扩增产物大小64 bp。

1.4 siRNA干扰

按照Lipofectamine 2000说明书的操作步骤将IRX2-siRNA和非特异性siRNA(Scramble)转染MG-63细胞,以未转染细胞为对照组。转染24 h后,收集细胞,测定IRX2基因的表达水平。

1.5 MTT检测

细胞增殖采用MTT法进行检测。将MG-63细胞以及转染IRX2-siRNA或Scramble的MG-63细胞1 ×105/mL接种于96孔板中,分别培养24、48、72、96 h,加入MTT(5 mg/mL)并继续培养4 h。然后添加 100 μL DMSO。在酶联免疫分析仪上检测光密度值[D(490)]。

1.6 细胞周期分析

将转染IRX2-siRNA、Scramble的MG-63细胞及对照组细胞接种于6孔板中培养24 h后收集细胞,用冷的70%乙醇对细胞进行固定,经PBS清洗后,将细胞悬浮于含PI(500 μg/mL)和RNase A(1 mg/mL)的PBS溶液中并孵育30 min,上流式细胞仪对细胞周期进行分析检测。

1.7 Western blot检测

提取细胞总蛋白并测定蛋白总浓度。电泳,转膜,室温孵育1 h,随后将膜与兔抗IRX2(1 ∶200)、兔抗p-JAK3、兔抗JAK3、兔抗STAT5和p-STAT5一抗(1 ∶200)4 ℃孵育过夜,用TBST清洗膜10 min后将膜与辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h,最后用TBST清洗10 min,采用增强化学发光法测定蛋白质的相对量。

1.8 质粒转染

将纯化的IRX2 PCR产物与质粒pcDNA3.1分别用EcoR V和Hind Ⅲ双切酶处理构建真核表达质粒pcDNA3.1-IRX2。将处于对数期的MG-63细胞接种于6孔板中培养,待细胞长至70%汇合时,根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将pcDNA3.1空载质粒和pcDNA3.1-IRX2重组质粒分别转染MG-63细胞,以未转染质粒的MG-63细胞为对照组。转染24 h 后收集细胞。

1.9 统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件,计量资料以x±s表示,进行独立样本t检验或单因素方差分析。

2 结果 2.1 IRX2在骨肉瘤细胞系中的表达

IRX2在骨肉瘤细胞系中mRNA和蛋白的表达均高于成骨细胞系Hfob1.19(P<0.05,图 12)。

a:P<0.05,与Hfob1.19细胞比较图 1 RT-PCR检测各骨肉瘤细胞系中IRX2 mRNA表达
1: Hfob1.19; 2: MG-63; 3: OS732; 4: U-20S; 5: HOS; 6: SAOS-2 A:Western blot 检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与Hfob1.19细胞比较图 2 倒置相差显微镜下观察,Western blot检测各骨肉瘤细胞系中IRX2蛋白表达
2.2 IRX2-siRNA干扰对骨肉瘤细胞增殖的影响

为进一步研究IRX2对骨肉瘤细胞增殖的影响,对MG-63细胞进行体外培养(图 3),用IRX2-siRNA沉默IRX2的表达,检测MG-63细胞的增殖。结果发现: IRX2-siRNA使IRX2 mRNA相对表达水平从1.00± 0.08下降至0.36±0.06(P<0.05),而Scramble组 IRX2 mRNA表达(1.02±0.05)无变化(P>0.05)。Western blot结果也显示IRX2-siRNA可沉默IRX2蛋白的表达(P<0.05,图 4)。IRX2表达沉默后,MG-63细胞的增殖能力降低,且随着培养时间的延长,IRX2-siRNA对细胞增殖的抑制作用具有时间依赖效应(P<0.05,图 5)。

A:对照组;B:Scramble组;C:IRX2-siRNA组图 3 倒置相差显微镜下观察IRX2-siRNA 干扰对MG-3细胞形态的影响 (×40)
1: 对照组;2:Scramble组; 3: IRX2-siRNA组
A:Western blot 检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较
图 4 Western blot检测IRX2-siRNA干扰对IRX2蛋白表达的影响
a:P<0.05,与对照组比较图 5 MTT检测IRX2-siRNA干扰对MG-3细胞增殖的影响
2.3 IRX2-siRNA干扰对骨肉瘤细胞周期的影响

对照组G0/G1期细胞比例为(61.03±11.26)%,S期为(15.84±1.76)%,G2/M期为(23.14± 3.19)%。IRX2-siRNA作用24 h后,G0/G1期细胞比例[(65.64± 7.39)%]略有增加,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);S期细胞比例[(23.93± 1.92)%]增加,而G2/M期[(10.44±1.99)%] 减少,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Scramble组细胞各期比例 [G0/G1:(57.95±5.78)%;S:(17.34±1.31)%;G2/M:(24.68± 2.57)%]与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,图 6)。

A:对照组;B:Scramble组;C:IRX2-siRNA组图 6 流式细胞仪检测IRX2-siRNA干扰对骨肉瘤细胞周期的影响
2.4 IRX2通过上调JAK3/STAT5信号通路调控骨肉瘤细胞的增殖

对pcDNA3.1-IRX2转染效率研究发现,与对照组(1.00±0.09)比较,pcDNA3.1-IRX2(3.24±0.21)可上调IRX2 mRNA表达(P<0.05),而pcDNA3.1转染(1.10±0.11)对IRX2表达无影响(P>0.05)。 pcDNA3.1-IRX2还可提高IRX2蛋白表达(图 7)。 Western blot 检测结果显示IRX-siRNA可抑制JAK3和STAT5的水平,而转染pcDNA3.1-IRX2过表达IRX2可上调JAK3水平(P<0.05,图 8)和STAT5的水平(P<0.05,图 9)。采用JAK3抑制剂cp-690550和STAT5抑制剂哌咪清(pimozide)处理细胞后,检测结果显示:过表达IRX2可促进MG-63细胞的增殖;JAK3抑制剂cp-690550和STAT5抑制剂哌咪清均可抑制MG-63细胞的增殖;cp-690550和哌咪清可部分抑制pcDNA3.1-IRX2诱导的细胞增殖上调(P<0.05,图 10)。

1: 对照组;2:pcDNA3.1组; 3:pcDNA3.1-IRX2组
A:Western blot 检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较
图 7 Western blot检测pcDNA3.1-IRX2转染对MG-63细胞IRX2 蛋白表达的影响
1: 对照组;2:Scramble组; 3: IRX-siRNA组; 4: pcDNA3.1 组; 5:pcDNA3.1-IRX2组
A:Western blot 检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较
图 8 Western blot检测pcDNA3.1-IRX2转染对MG-63细胞中JAK3活性的影响
1: 对照组;2:Scramble组; 3: IRX-siRNA组; 4: pcDNA3.1 组; 5:pcDNA3.1-IRX2组
A:Western blot 检测;B:半定量分析 a:P<0.05,与对照组比较
图 9 Western blot检测pcDNA3.1-IRX2转染对MG-63细胞中STAT5活性的影响
1:对照组;2:pcDNA3.1-IRX2组;3:cp-690550处理组;4:Pimozide 处理组;5:pcDNA3.1-IRX2+ cp-690550处理组;6:pcDNA3.1-IRX2+ Pimozide处理组;7:pcDNA3.1-IRX2+ cp-690550+ Pimozide处理组;a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与pcDNA3.1-IRX2组比较图 10 MTT检测pcDNA3.1-IRX2转染对MG-63细胞中STAT5表达的影响
3 讨论

IRX2基因定位于5号染色体短臂5p15.33位点或附近。有研究报道IRX2基因的表达可能与肿瘤的发生、发展具有一定的关系。余爽等[7]发现源发性肝癌组织IRX2表达水平显著低于癌旁组织,且其表达水平与肝癌组织的分化程度具有显著的正相关性。然而,也有研究发现IRX2在软组织肉瘤[8]、头颈部癌[4]和乳腺癌[3]等肿瘤中的表达水平均显著上调。本研究对骨肉瘤中IRX表达水平的检测发现,IRX2在多种人骨肉瘤细胞系的表达水平均显著高于人成骨细胞系,预示着IRX2可能与骨肉瘤的发展具有一定的联系。因此,本研究应用IRX2 siRNA沉默IRX2在骨肉瘤细胞中的表达,检测其对细胞增殖的影响,结果发现IRX2基因沉默显著降低了骨肉瘤细胞的增殖率。表明IRX2对于骨肉瘤的发展具有重要的调控作用。

细胞周期的紊乱导致细胞的异常增殖是癌症的主要特征。细胞周期系统可通过上游信号网络作为信号转导的整合点,是诊断和治疗干预的另一个靶点[9]。 研究表明IRX2可通过与多种细胞周期调节因子如P21、P27以及细胞周期蛋白D1的相互作用,从而参与细胞周期的调节[10]。本研究结果证实抑制IRX2的表达可以导致骨肉瘤细胞周期阻滞,主要表现为S期细胞增加,G2/M期细胞比例减少,表明抑制 IRX2可将骨肉瘤细胞阻滞在S期,从而抑制细胞的增殖。

JAK/STAT信号通路是细胞对细胞因子和生长因子进行应答的主要通路,这些细胞应答的方式主要有增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞存活[11]。Czystowska等[12]对人T细胞的研究发现IRX2可显著上调JAK3 的表达水平,并激活STAT5。因此,为进一步了解IRX2影响骨肉瘤细胞增殖和周期的具体机制,本实验对IRX2与JAK3/STAT5通路之间的相关性进行了检测,结果发现IRX2可显著上调磷酸化JAK3和磷酸化STAT5的表达水平,且进一步的研究发现,抑制JAK3/STAT5信号通路可减弱显著IRX2对骨肉瘤细胞增殖的调控作用,表明IRX2可能通过JAK3/STAT5信号通路作用于骨肉瘤细胞增殖。

综上所述,本研究发现IRX2在骨肉瘤中表达显著上调,且这种上调会通过JAK/STAT信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖,提示IRX2可能是治疗骨肉瘤新的靶点。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201507098
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

史继德,李宏维,周斌,王颢,张海鸿
Shi Jide, Li Hongwei, Zhou Bin, Wang Hao, Zhang Haihong
siRNA干扰IRX2对骨肉瘤细胞增殖的影响及其机制
Effect of IRX2-siRNA interference on cell proliferation in human osteosarcoma and related mechanism
第三军医大学学报, 2015, 37(24): 2448-2452
J Third Mil Med Univ, 2015, 37(24): 2448-2452.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201507098

文章历史

收稿:2015-08-06
修回:2015-08-14

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