骨肉瘤具有很高的局部浸润和早期转移趋势,转移性骨肉瘤5年生存率仅为10%~20%[1, 2]。因此,寻找新的治疗靶点是骨肉瘤临床治疗的迫切需求。有研究发现易洛魁族同源盒2(iroquois homebox 2,IRX2) 基因的表达与部分肿瘤的发展有关[3, 4]。IRX主要编码TALE超家族蛋白含高度保守同源盒序列的同源蛋白,包括IRX1~6六个家族成员[5]。本研究拟通过siRNA的干扰分析IRX2对骨肉瘤细胞增殖和周期的调节作用和相关机制。
1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂人骨肉瘤细胞系MG-63、OS732、U-20S、HOS、SAOS-2及人成骨细胞系Hfob1.19均购自美国ATCC,MTT、DMSO、青霉素和链霉素(Sigma公司),SYBR® Premix Ex TaqTM 试剂盒(TaKaRa公司),TRIzol、Lipofectamine 2000、pcDNA3.1(Invitrogen公司),硝酸纤维素膜(BioTEKE公司),兔抗IRX2(Aviva System Biology公司),兔抗p-JAK3、兔抗JAK3、兔抗STAT5和p-STAT5及辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)。
1.2 细胞培养将人骨肉瘤细胞系MG-63、OS732、U-20S、HOS、SAOS-2及人成骨细胞系Hfob1.19置于含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基、37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养。
1.3 RT-PCR检测TRIzol提取细胞中总RNA并测定其浓度和纯度后,用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA,转录的cDNA置于-20 ℃储存备用。RT-PCR操作步骤参照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行。RT-PCR反应体系为20 μL体系:2 μL cDNA,上下游引物各0.4 μL,SYBR®Premix Ex Taq 10 μL,灭菌蒸馏水7.2 μL。RT-PCR反应程序为:94 ℃预热2 min;94 ℃ 变性20 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s共40个循环。以β-actin为阴性对照。IRX2上游引物[6]:5′-ACGCACACCACCGGAATG-3′,下游引物:5′-ATGGATAGGCCGCACTGC-3′,扩增产物大小64 bp。
1.4 siRNA干扰按照Lipofectamine 2000说明书的操作步骤将IRX2-siRNA和非特异性siRNA(Scramble)转染MG-63细胞,以未转染细胞为对照组。转染24 h后,收集细胞,测定IRX2基因的表达水平。
1.5 MTT检测细胞增殖采用MTT法进行检测。将MG-63细胞以及转染IRX2-siRNA或Scramble的MG-63细胞1 ×105/mL接种于96孔板中,分别培养24、48、72、96 h,加入MTT(5 mg/mL)并继续培养4 h。然后添加 100 μL DMSO。在酶联免疫分析仪上检测光密度值[D(490)]。
1.6 细胞周期分析将转染IRX2-siRNA、Scramble的MG-63细胞及对照组细胞接种于6孔板中培养24 h后收集细胞,用冷的70%乙醇对细胞进行固定,经PBS清洗后,将细胞悬浮于含PI(500 μg/mL)和RNase A(1 mg/mL)的PBS溶液中并孵育30 min,上流式细胞仪对细胞周期进行分析检测。
1.7 Western blot检测提取细胞总蛋白并测定蛋白总浓度。电泳,转膜,室温孵育1 h,随后将膜与兔抗IRX2(1 ∶200)、兔抗p-JAK3、兔抗JAK3、兔抗STAT5和p-STAT5一抗(1 ∶200)4 ℃孵育过夜,用TBST清洗膜10 min后将膜与辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h,最后用TBST清洗10 min,采用增强化学发光法测定蛋白质的相对量。
1.8 质粒转染将纯化的IRX2 PCR产物与质粒pcDNA3.1分别用EcoR V和Hind Ⅲ双切酶处理构建真核表达质粒pcDNA3.1-IRX2。将处于对数期的MG-63细胞接种于6孔板中培养,待细胞长至70%汇合时,根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将pcDNA3.1空载质粒和pcDNA3.1-IRX2重组质粒分别转染MG-63细胞,以未转染质粒的MG-63细胞为对照组。转染24 h 后收集细胞。
1.9 统计学分析采用SPSS 11.0统计软件,计量资料以x±s表示,进行独立样本t检验或单因素方差分析。
2 结果 2.1 IRX2在骨肉瘤细胞系中的表达IRX2在骨肉瘤细胞系中mRNA和蛋白的表达均高于成骨细胞系Hfob1.19(P<0.05,图 1、2)。
2.2 IRX2-siRNA干扰对骨肉瘤细胞增殖的影响为进一步研究IRX2对骨肉瘤细胞增殖的影响,对MG-63细胞进行体外培养(图 3),用IRX2-siRNA沉默IRX2的表达,检测MG-63细胞的增殖。结果发现: IRX2-siRNA使IRX2 mRNA相对表达水平从1.00± 0.08下降至0.36±0.06(P<0.05),而Scramble组 IRX2 mRNA表达(1.02±0.05)无变化(P>0.05)。Western blot结果也显示IRX2-siRNA可沉默IRX2蛋白的表达(P<0.05,图 4)。IRX2表达沉默后,MG-63细胞的增殖能力降低,且随着培养时间的延长,IRX2-siRNA对细胞增殖的抑制作用具有时间依赖效应(P<0.05,图 5)。
2.3 IRX2-siRNA干扰对骨肉瘤细胞周期的影响对照组G0/G1期细胞比例为(61.03±11.26)%,S期为(15.84±1.76)%,G2/M期为(23.14± 3.19)%。IRX2-siRNA作用24 h后,G0/G1期细胞比例[(65.64± 7.39)%]略有增加,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);S期细胞比例[(23.93± 1.92)%]增加,而G2/M期[(10.44±1.99)%] 减少,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Scramble组细胞各期比例 [G0/G1:(57.95±5.78)%;S:(17.34±1.31)%;G2/M:(24.68± 2.57)%]与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,图 6)。
2.4 IRX2通过上调JAK3/STAT5信号通路调控骨肉瘤细胞的增殖对pcDNA3.1-IRX2转染效率研究发现,与对照组(1.00±0.09)比较,pcDNA3.1-IRX2(3.24±0.21)可上调IRX2 mRNA表达(P<0.05),而pcDNA3.1转染(1.10±0.11)对IRX2表达无影响(P>0.05)。 pcDNA3.1-IRX2还可提高IRX2蛋白表达(图 7)。 Western blot 检测结果显示IRX-siRNA可抑制JAK3和STAT5的水平,而转染pcDNA3.1-IRX2过表达IRX2可上调JAK3水平(P<0.05,图 8)和STAT5的水平(P<0.05,图 9)。采用JAK3抑制剂cp-690550和STAT5抑制剂哌咪清(pimozide)处理细胞后,检测结果显示:过表达IRX2可促进MG-63细胞的增殖;JAK3抑制剂cp-690550和STAT5抑制剂哌咪清均可抑制MG-63细胞的增殖;cp-690550和哌咪清可部分抑制pcDNA3.1-IRX2诱导的细胞增殖上调(P<0.05,图 10)。
3 讨论IRX2基因定位于5号染色体短臂5p15.33位点或附近。有研究报道IRX2基因的表达可能与肿瘤的发生、发展具有一定的关系。余爽等[7]发现源发性肝癌组织IRX2表达水平显著低于癌旁组织,且其表达水平与肝癌组织的分化程度具有显著的正相关性。然而,也有研究发现IRX2在软组织肉瘤[8]、头颈部癌[4]和乳腺癌[3]等肿瘤中的表达水平均显著上调。本研究对骨肉瘤中IRX表达水平的检测发现,IRX2在多种人骨肉瘤细胞系的表达水平均显著高于人成骨细胞系,预示着IRX2可能与骨肉瘤的发展具有一定的联系。因此,本研究应用IRX2 siRNA沉默IRX2在骨肉瘤细胞中的表达,检测其对细胞增殖的影响,结果发现IRX2基因沉默显著降低了骨肉瘤细胞的增殖率。表明IRX2对于骨肉瘤的发展具有重要的调控作用。
细胞周期的紊乱导致细胞的异常增殖是癌症的主要特征。细胞周期系统可通过上游信号网络作为信号转导的整合点,是诊断和治疗干预的另一个靶点[9]。 研究表明IRX2可通过与多种细胞周期调节因子如P21、P27以及细胞周期蛋白D1的相互作用,从而参与细胞周期的调节[10]。本研究结果证实抑制IRX2的表达可以导致骨肉瘤细胞周期阻滞,主要表现为S期细胞增加,G2/M期细胞比例减少,表明抑制 IRX2可将骨肉瘤细胞阻滞在S期,从而抑制细胞的增殖。
JAK/STAT信号通路是细胞对细胞因子和生长因子进行应答的主要通路,这些细胞应答的方式主要有增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞存活[11]。Czystowska等[12]对人T细胞的研究发现IRX2可显著上调JAK3 的表达水平,并激活STAT5。因此,为进一步了解IRX2影响骨肉瘤细胞增殖和周期的具体机制,本实验对IRX2与JAK3/STAT5通路之间的相关性进行了检测,结果发现IRX2可显著上调磷酸化JAK3和磷酸化STAT5的表达水平,且进一步的研究发现,抑制JAK3/STAT5信号通路可减弱显著IRX2对骨肉瘤细胞增殖的调控作用,表明IRX2可能通过JAK3/STAT5信号通路作用于骨肉瘤细胞增殖。
综上所述,本研究发现IRX2在骨肉瘤中表达显著上调,且这种上调会通过JAK/STAT信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖,提示IRX2可能是治疗骨肉瘤新的靶点。
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