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APE1乙酰化调节电离辐射诱导的HeLa细胞自噬
张志敏, 杨镇洲, 何 昊, 蓝保华, 李 钱, 吴 艳, 王 帅, 李 娟    
400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心
摘要目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶∕氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)乙酰化对电离辐射诱导HeLa细胞自噬的调节作用。 方法 给予Elekta precise直线加速器处理HeLa细胞及子系细胞APE1WT和APE1K6R/K7R,应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法检测APE1乙酰化修饰及Beclin1/Bcl2的结合,流式细胞仪检测细胞自噬的水平,免疫荧光激光共聚焦检测LC3的聚集,Western blot检测APE1、LC3和p62的表达。 结果 HeLa细胞APE1乙酰化水平随着照射剂量的增加和照射后时间的延长而逐渐升高(P<0.05)。HeLa细胞 LC3Ⅱ的表达与照射剂量呈正相关,而与p62呈负相关(P<0.05);电离辐射促进细胞的自噬水平和LC3的聚集。电离辐射后,LC3Ⅱ上调;与对照组APE1WT相比,APE1K6R/K7R细胞Beclin1/Bcl2结合增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,p62表达上调(P<0.05)。 结论 APE1乙酰化通过Beclin1/Bcl2途径调节电离辐射诱导的HeLa细胞自噬。
关键词电离辐射     APE1乙酰化     自噬     宫颈癌    
APE1 acetylation regulates autophagy induced by ionizing radiation in HeLa cells
Zhang Zhimin, Yang Zhenzhou, He Hao, Lan Baohua, Li Qian, Wu Yan, Wang Shuai, Li Juan     
Cancer Center, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81272499)
Corresponding author: Yang Zhenzhou, E-mail: yangzz1970@163.com
Abstract:Objective To explore the relationship between apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1 (APE1) acetylation and autophagy induced by ionizing radiation in HeLa cells. Methods HeLa cells, APE1K6R/K7R cells and APE1WT cells underwent radiation treatment with Elekta precise linear accelerator, and APE1 acetylation and interaction of Beclin1 and Bcl2 were detected by co-immunoprecipitation (Co-IP). Flow cytometry was used to analyze HeLa cell autophagy level, LC3 accumulation was observed by immunofluorescence assay, and Western blotting was adopted to measure the expression of APE1, LC3 and p62. Results The APE1 acetylation was increased along with the increase of the radiation dose and the time after radiation in HeLa cells, and the increase of APE1 acetylation was in a time- and dose-dependent manner (P<0.05). LC3Ⅱ expression was positively correlated with the radiation dose in HeLa cells, while p62 expression was opposite (P<0.05). LC3 accumulation and autophagy increased after ionizing radiation, and the LC3Ⅱ expression was up-regulated (P<0.05). Compared with APE1WT cells, the interaction of Beclin1 and Bcl2 was enhanced in APE1K6R/K7R cells, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio was decreased, and p62 expression was up-regulated after ionizing radiation (P<0.05). Conclusion APE1 acetylation is increased after ionizing radiation, which can promote radiation-induced autophagy via Beclin1/Bcl2 pathway in HeLa cells.
Key words: ionizing radiation     APE1 acetylation     autophagy     cervical cancer    

放射治疗是晚期肿瘤主要的治疗手段,但放疗抵抗的现象普遍存在。APE1/Ref-1,DNA损伤修复和氧化还原(redox)双功能基因,作为提高放射治疗敏感性的靶点已经被广泛证实,但具体机制还在探索中[1]。APE1是一个多功能蛋白,具有氧化还原一些转录因子(如p53、AP-1、PTEN、NF-κb等)和DNA 碱基损伤修复的功能。乙酰化、磷酸化、泛素化都是APE1翻译后修饰的方式,但APE1乙酰化修饰尤为重要。APE1的N末端有多个位点能被乙酰化转移酶修饰[2],尤其K6/K7位点的乙酰化修饰与APE1多种活性密切相关,如与nCaRE序列、YB-1介导的MDR1基因激活和BER功能密切相关[3]。自噬是细胞的一种适应性反应,应激刺激时细胞自我吞噬和降解细胞内的长寿蛋白和细胞器,从而维持细胞存活。细胞自噬与肿瘤的发生、发展、治疗存在密切的关系。为了探索APE1乙酰化与电离辐射(ionizing radiation,IR)诱导的细胞自噬之间的关系,本研究采用IR处理,观察HeLa细胞APE1乙酰化水平、细胞自噬水平的变化及可能的机制,为APE1作为放射治疗的靶点提供进一步的理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

人宫颈癌HeLa 细胞、APE1WT和APE1K6R/K7R细胞由第三军医大学大坪医院野战外科研究所胸外科实验室惠赠,大坪医院肿瘤中心实验室传代保存。免疫兔血清IgG、免疫小鼠血清IgG购自Sigma 公司,protein A/G-agaroseresin购自Beyotime 公司,自噬检测染色试剂盒购自ENZO 公司,ECL 检测试剂盒、HRP 标记羊抗小鼠IgG 抗体、HRP 标记羊抗兔IgG 抗体购自Santa Cruz 公司,兔抗人LC3、p62和AC-APE1(APE1乙酰化 APE1 acetylation AC-APE1)多克隆抗体,兔抗人APE1 多克隆抗体、鼠抗人APE1单克隆抗体购自Abcom公司。

1.2 细胞培养和电离辐射

用含10% 胎牛血清,100 μg/mL青、链霉素的DMEM培养基,37℃、5%CO2,常规传代培养HeLa 细胞、APE1WT和APE1K6R/K7R细胞,用1 μg/mL doxycycline(DOX)的α-MEM培养基诱导APE1WT和APE1K6R/K7R细胞。培养细胞贴壁密度约80%,用Elekta pricise直线加速器(Elekta,瑞典)照射细胞。

1.3 流式细胞术检测细胞周期

接种处于对数生长期HeLa细胞,给予0、2、4 Gy剂量的IR,用ENZO 自噬检测试剂盒染色后流式细胞仪检测。重复实验3次。

1.4 Western blot 检测蛋白表达

用上样缓冲液稀释蛋白样品,电泳165 V在聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白,用NC膜湿法400 mA 转印,分别与单克隆抗体及HRP偶联二抗孵育,用Super Signal West Pico Chem I luminescent Substrate 试剂盒化学发光,胶片显影。重复实验3 次。

1.5 免疫共沉淀(Co-IP)

用IP 细胞裂解液冰上裂解细胞,测定蛋白浓度。取蛋白样品和种属相同的IgG 与重悬的protein A+G agarose,4℃摇动30 min,上清加入一抗,4℃过夜,次日吸取protein A+ G agarose上清。上样缓冲液重悬,100℃蛋白变性。重复实验3 次。

1.6 免疫荧光标记结合激光共聚焦显微镜观察

接种APE1WT和APE1K6R/K7R细胞,固定,打孔,漂洗,封闭;附LC3 抗体,4℃过夜;FITC 绿光标记,37℃孵育1 h,含有DAPI的封片剂封片,第三军医大学中心实验室激光共聚焦室照相。重复实验3 次。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件,IR后A549细胞内AC-APE1、LC3、p62蛋白表达水平以x±s表示,采用单因素方差分析比较多组间均数。

2 结果 2.1 电离辐射促进HeLa细胞APE1乙酰化修饰

为了探索电离辐射与APE1乙酰化修饰之间的关系,以2 Gy剂量照射HeLa细胞后 0、6、12、24 h和0、2、4 Gy剂量照射2 h后,发现HeLa细胞AC-APE1随着照射后时间的推移和照射剂量的增加而逐渐上调,各时间段与0 h比较,各剂量与0 Gy剂量比较,差异均有统计学意义(P<0.01),呈现出时间依赖性和剂量依赖性。见图 1

A:2 Gy剂量照射处理HeLa细胞0、6、12、24 h后Co-IP检测APE1乙酰化水平;B:0、2、4 Gy剂量照射HeLa细胞2 h后Co-IP检测APE1乙酰化水平;C:不同时间APE1乙酰 化水平半定量分析;a:P<0.01,与0 h比较;D:不同剂量APE1乙酰化水平半定量分析;a:P<0.01,与0 Gy剂量比较图 1 电离辐射促进HeLa细胞APE1乙酰化修饰
2.2 电离辐射促进HeLa细胞自噬

照射HeLa细胞0、2、4 Gy剂量2 h后,LC3Ⅱ的表达与照射剂量呈正相关,而p62与LC3Ⅱ趋势相反,与0 Gy剂量比较,差异有统计学意义(P<0.01)(图 2AD),流式细胞仪检测结果显示,0、2、4 Gy剂量相应的自噬诱导百分数:1.4%、3.5%、8.4%(图 2E),与Western blot 的结果相吻合。 免疫荧光激光共聚焦证实电离辐射后,LC3的聚集(绿色)明显增加(图 3)。这些结果显示电离辐射诱导细胞自噬,具有剂量依赖性。

A、B:0、2、4 Gy剂量照射HeLa细胞2 h后Western blot 检测LC3和p62的表达;C:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ半定量分析 a:P<0.01,与0 Gy 剂量比较;D:p62表达半定量分析 a:P<0.01,与0 Gy剂量比较;E:0、2、4 Gy剂量照射HeLa细胞24 h后流式细胞仪检测细胞自噬水平图 2 电离辐射促进HeLa细胞自噬
利用LC3抗体和FITC-Green-标记的二抗检测LC3的聚集(绿色),DAPI作为细胞核染料(蓝色),merge为融合图图 3 0、4 Gy剂量照射HeLa细胞2 h后激光共聚焦显微镜观察LC3的聚集
2.3 APE1乙酰化修饰调控HeLa细胞自噬水平

为了证明APE1乙酰化调节电离辐射诱导的细胞自噬,利用APE1 内源性敲低组(CL3)和对照组(SCR)的HeLa细胞,并在此基础上构建HeLa 子系细胞,K6/K7 位点突变的APE1K6R/K7R和对照组APE1WT,APE1K6R/K7R乙酰化水平明显低于APE1WT组。APE1K6R/K7R 细胞LC3Ⅱ 表达水平低于对照组,与APE1WT组比较,差异有统计学意义(P<0.01);电离辐射后,LC3Ⅱ表达上调;而p62 的表达始终与LC3Ⅱ呈负相关,与照射后的APE1WT组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。同上述处理,CO-IP结果显示,APE1K6R/K7R 细胞促进Beclin1/Bcl2的相互结合,电离辐射抑制Beclin1/Bcl2的结合。见图 4

A:Western blot检测APE1表达 1:APE1敲低(CL3)细胞;2:对照(SCR)细胞;3:APE1K6R/K7R 细胞;4:对照APE1WT细胞;B:CO-IP 检测AC-APE1水平 1:IGg;2:APE1WT 细胞;3:APE1K6R/K7R 细胞;C、D: Western blot检测APE1、LC3和p62表达;E:CO-IP检测Beclin1/Bcl2的相互作用;F:p62表达半定量;G:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白半定量 1:APE1WT细胞;2:APE1K6R/K7R 细胞;3:4 Gy剂量照 射APE1WT细胞;4:4 Gy剂 量照射APE1K6R/K7R 细胞;a:P<0.01,与APE1WT细胞比较;b:P<0.01,与4 Gy剂量照射APE1WT细胞比较图 4 APE1乙酰化修饰调控HeLa细胞自噬水平
3 讨论

APE1是小鼠胚胎存活不可或缺的基因,APE1的表达水平与肿瘤放化疗抵 抗之间存在密切的联系,如抑制APE1氧化还原功能增强细胞对氧化应激的敏感性[4],而APE1又是碱基切除修饰(base excision repair,BER)的限速酶,APE1的高表达抵抗肿瘤治疗诱导的DNA损伤[2]。APE1乙酰化修饰是APE1最重
要的翻译后修饰形式,与APE1氧化还原和碱基切除修复功能密切相关[5]。APE1-K6/K7 位点的乙酰化调节APE1 蛋白的AP 内切酶活性,并通过改变APE1 与BER相关蛋白(如XRCC1)的相互作用调节细胞BER 活性[6]。最近的研究提出,氧化应激和DNA损伤反应诱导细胞自噬[7],但APE1乙酰化与细胞自噬之间的关系还不清楚。

本实验首先通过Co-IP的方法检测APE1乙酰化,发现APE1乙酰化水平随着电离辐射剂量的增加和照射后时间的延长而增加(图 1)。Lirussi等[8]认为,基因毒性应激促进APE1乙酰化,并参与调节BER活性。接着,本实验通过观察LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的表达检测自噬活性,发现随着电离辐射剂量的增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ不断增加,而p62表达下调,然后通过流式细胞仪和免疫荧光的方法进一步证实,电离辐射促进细胞自噬水平(图 23)。电离辐射后释放大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)对细胞造成广泛和持久的DNA 氧化性损伤,从而激活细胞自噬。Liang等[9]在多种细胞中报道了相同的结果。最后,本实验通过APE1-K6/K7 位点突变的APE1K6R/K7R细胞调控APE1乙酰化,发现APE1K6R/K7R细胞自噬活性明显抑制,电离辐射后,APE1K6R/K7R细胞自噬活性明显低于对照组(图 4)。APE1-K6/K7 位点突变抑制BER活性,促进DNA损伤,为了维持DNA合成、稳定,BER活性在自噬的启动上发挥关键的作用[10]。但Shan等[11]报道了APE1主要乙酰化位点突变明显的增加细胞ROS水平,在饥饿诱导的细胞自噬中ROS是最佳的诱导剂。然而APE1K6R/K7R细胞自噬水平却低于对照组,可能因为APE1乙酰化主要通过调控DNA损伤反应调控细胞自噬。本实验发现APE1K6R/K7R细胞促进Bcl2/Beclin1的相互作用(图 4),Bcl2/Beclin1的结合是自噬主要的负向调控途径。Zhao等[12]报道APE1/Bcl2通过BH位点相互作用抑制BER活性,进一步验证了APE1乙酰化通过调节BER活性,改变DNA损伤反应诱导的细胞自噬。本研究结果显示,电离辐射促进APE1乙酰化,通过抑制BER活性促进DNA损伤诱导的细胞自噬。以上结果表明,APE1-K6/K7 位点突变通过促进Bcl2/Beclin1的结合抑制细胞自噬。

总之,本研究结果提示电离辐射促进APE1 乙酰化修饰,并提高细胞自噬水平。应用APE1乙酰化关键位点的突变可以抑制电离辐射诱导的细胞自噬水平。今后,APE1乙酰化调节细胞自噬的机制需要进一步深入研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201506152
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

张志敏,杨镇洲,何昊,蓝保华,李钱,吴艳,王帅,李娟
Zhang Zhimin, Yang Zhenzhou, He Hao, Lan Baohua, Li Qian, Wu Yan, Wang Shuai, Li Juan
APE1乙酰化调节电离辐射诱导的HeLa细胞自噬
APE1 acetylation regulates autophagy induced by ionizing radiation in HeLa cells
第三军医大学学报, 2016, 38(4): 380-384
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(4): 380-384.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201506152

文章历史

收稿:2015-06-30
修回:2015-08-17

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