2. 400700 重庆，重庆市第九人民医院药剂科
2. Department of Pharmacy, Chongqing Ninth People’s Hospital, Chongqing, 400700, China
咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜂胶[1]和红景天[2]中提取的一种黄酮类活性物质。近年来研究表明，CAPE具有保护缺血/再灌注或异丙肾上腺素(ISO)诱导引起的心肌损伤作用[3, 4]。本课题组设计合成了一系列CAPE衍生物，研究发现CAPE对硝基衍生物对硝基咖啡酸苯乙酯(CAPE-NO2)是这些衍生物中免疫调节作用和抗血小板凝集活性最强的化合物[5, 6]。CAPE-NO2与很多治疗心脏疾病的药物，如硝苯地平、尼莫地平结构相似，都具有对硝基、苯环和不饱和基团。目前，CAPE-NO2心肌保护作用的研究少见文献报道，本课题利用ISO诱导大鼠心肌缺血损伤，研究CAPE-NO2对心肌的保护作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，购于重庆医科大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK(渝)2012-0001。
1.2 药物、试剂与仪器对硝基咖啡酸苯乙酯(参照文献[5]合成)；TTC染液(碧云天生物技术研究所)。超氧化物歧化酶试剂盒(A001-2)、过氧化氢酶试剂盒(A007-1)、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(A005)(南京建成生物工程研究所);苯巴比妥钠(sigma)；异丙肾上腺素(ISO)(上海梯希爱化成工业发展有限公司)。TGL-16台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；生物机能实验系统BL-420F(成都泰盟科技有限公司)；酶标仪TECAN(Infinite 200 PRO)。
1.3 方法 1.3.1 心肌缺血模型制作与给药健康雄性SD大鼠30只，利用简单随机分组法分成5组。
空白对照组(Control组)：腹腔注射溶剂(二甲基亚砜的0.9%NaCl溶液，体积比=1 ∶104)1.0 mL/kg，每日1次，连续7 d。第7天腹腔注射后2 h，皮下注射生理盐水，第8天重复给生理盐水1次。
药物对照组(CAPE-NO2组)：腹腔注射CAPE-NO2 50 μg/kg，每日1次，连续7 d。第7天腹腔注射 后2 h，皮下注射生理盐水，第8天重复给生理盐水1次。
模型对照组(ISO组)：腹腔注射溶剂1.0 mL/kg，每日1次，连续7 d。第7天腹腔注射后2 h，皮下注射1次ISO 85 mg/kg，第8天重复给ISO 1次。
CAPE对照组(CAPE+ISO组)：腹腔注射CAPE 50 μg/kg，每日1次，连续7 d。第7天腹腔注射后2 h，皮下注射1次ISO 85 mg/kg，第8天重复给ISO 1次。
CAPE-NO2实验组(CAPE-NO2+ ISO组)：腹腔注射CAPE-NO2 50 μg/kg，每日1次，连续7 d。第7天腹腔注射后2 h，皮下注射1次ISO 85 mg/kg，第8天重复给ISO 1次。
1.3.2 心电图监测于最后1次给ISO 12 h后用苯巴比妥钠 (40 mg/kg)麻醉大鼠，用生物机能实验系统监测大鼠二导联心电图。
1.3.3 心脏梗死面积的测定 [7]监测心电图后摘取心脏，置-20 ℃冰箱1 h，自心尖向心底将心脏横切成1.5 mm厚度的组织切片，将切片置pH 7.4的1%TTC缓冲染液中，37 ℃恒温下避光染色10 min，随后转入10%甲醛溶液中固定，用Image-Pro Plus 8.0图像处理软件计算梗死面积。
1.3.4 酶活性的测定取心脏组织适量，制成10％的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作测定SOD、CAT、GSH-Px酶活性。
1.3.5 NO含量的测定采用Griess方法[8]测定NO含量。取心脏组织适量进行匀浆，制成10％的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，依次与Griess试剂A、B水浴反应，测其光密度值，计算NO2-浓度。
1.4统计学分析所得数据采用PASW statistics 18统计软件进行分析，所有数据均用
±s表示，组间显著性由One-way ANOVA中的Tukey检测。
CAPE-NO2组心电图与Control组相比，几乎无变化，表明CAPE-NO2本身对心电不产生显著影响；模型对照组出现ST段显著抬高(P < 0.01)，表明ISO造模成功；CAPE+ISO组和CAPE-NO2+ISO组与ISO组比较，ST段出现下降，CAPE-NO2+ISO组ST段下降更显著(P < 0.05)。结果表明CAPE-NO2能部分恢复ISO引起的大鼠心电图紊乱，且效果优于CAPE。见图 1。
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| A：Control组心电图；B：CAPE-NO2组心电图；C：ISO组心电图；D：CAPE+ISO组心电图；E：CAPE-NO2+ISO组心电图；F：各组ST段抬高比较；G：各组QRS段延长比较；1：Control组；2：CAPE-NO2组；3：ISO组；4：CAPE+ISO组；5：CAPE-NO2+ISO组； a：P < 0.05，b：P < 0.01，与Control组比较；c：P < 0.05，与ISO组比较；d：P < 0.05，与CAPE+ISO组比较 图 1 各组大鼠二导联心电图 |
经TTC染色后，梗死心肌组织呈白色，正常组织呈红色。Control组(图 2A)和药物对照(图 2B)色泽鲜红均匀，无梗死灶出现，ISO组(图 2C)梗死灶明显，与Control组比较差异显著(P < 0.01)。CAPE+ISO组(图 2D)和CAPE-NO2+ISO组(图 2E)梗死面积与ISO组比较有不同程度的减小，且CAPE-NO2+ISO组 的梗死面积明显小于CAPE+ISO组(P < 0.01,表 1)。
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| A：Control组；B：CAPE-NO2组；C：ISO组；D：CAPE+ISO组；E：CAPE-NO2+ISO组 图 2 各组大鼠心脏横切的TTC染色观察 |
| (±s,n=6) | |
| 组别 | 梗死面积(%) |
| a：P < 0.01，与Control组比较；b：P < 0.05，c: P < 0.01,与ISO组比较；d：P < 0.01，与CAPE+ISO组比较 | |
| Control组 | 0 |
| CAPE-NO2组 | 0 |
| ISO组 | 47.90±10.11a |
| CAPE+ISO组 | 38.14±9.85b |
| CAPE-NO2+ISO组 | 8.11±2.32cd |
与Control组比较，CAPE-NO2组无明显变化，表明CAPE-NO2对机体抗氧化酶活性未产生影响。ISO组的抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性显著降低。与ISO组比较，CAPE+ISO组的3种抗氧化酶活性无明显变化，而CAPE-NO2+ISO组显著升高由ISO引起的抗氧化酶活性降低。见图 3。
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| A：各组血清中SOD值；B：各组血清中CAT值；C：各组血清中GSH-Px值；1：Control组；2：CAPE-NO2组；3：ISO组；4：CAPE+ISO组；5：CAPE-NO2+ISO组；a：P < 0.01，与Control组比较；b：P < 0.05，c: P < 0.01,与ISO组比较；d：P < 0.05,e: P < 0.01，与CAPE+ISO组比较 图 3 各组大鼠心肌组织抗氧化酶活性比较 |
与Control组比较，CAPE-NO2组NO2-浓度无显著变化，ISO组显著升高(P < 0.01)；与ISO组比较，CAPE+ISO组和CAPE-NO2+ISO组的NO2-浓度均下降，后者下降的更加显著。见图 4。
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| 1：Control组；2：CAPE-NO2组；3：ISO组；4：CAPE+ISO组； 5：CAPE-NO2+ISO组；a：P < 0.01，与Control组比较；b：P < 0.05，c：P < 0.01，与ISO组比较；d：P < 0.05，与CAPE+ISO组比较 图 4 各组大鼠心肌组织中NO2-浓度变化 |
异丙肾上腺素(ISO)是β受体激动剂，能引起心肌严重的应激反应导致心脏肌肉损伤性坏死[9]。注射高剂量的ISO诱导的心肌缺血，抑制左心室功能，与人类心肌梗死病理变化非常接近[10]。ECG异常抬高是确切诊断MI的主要标准，细胞膜功能损伤引起ST段抬高，表示了缺血和非缺血潜在的不同，这种变化可在急性心肌缺血患者或ISO诱导的心肌损伤大鼠中观察到[7]。ISO诱导的大鼠ECG中ST-段明显抬高可能是由于ISO加速了心肌坏死。连续2 d注射ISO使心电图QRS期延长，这也是心肌损伤的预兆之一[11]。本实验中，用CAPE和CAPE-NO2预处理显著抑制了ISO诱导的ST-段抬高、QRS段时间的延长，其中CAPE-NO2降低ISO诱导的ST-段抬高较CAPE明显，表明CAPE-NO2能够改善心肌缺血，且效果可能优于CAPE。
氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是一种普遍认可的确定心肌损伤面积的方法，能够提供可靠的坏死参数[12]。TTC与正常组织中的LDH反应形成红色的甲瓒，而缺血组织内LDH活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白[13]。ISO诱导大鼠心脏细胞膜损伤，LDH大量外漏，对TTC反应减少。CAPE与CAPE-NO2预处理降低了心肌损伤面积，红色区域与ISO比较明显增加，表明LDH的外漏减少，其中CAPE-NO2具有更强的降低心肌损伤的能力。因此，CAPE-NO2阻止细胞膜损伤，并且降低由ISO诱导的MI心肌损伤面积，保护心脏。
ISO自动氧化为醌类，与氧发生反应产生超氧阴离子和过氧化氢，导致氧化应激和消耗体内抗氧化系统。自由基清除酶包括SOD、CAT和GPx等，这些是细胞抗氧化损伤的第一道防线[7]。SOD催化O2-转化为H2O2，H2O2由CAT或GSH-Px降解[14]。在ISO模型大鼠中，过量产生的超氧阴离子使SOD失活，H2O2清除酶CAT和GSH-Px的活性降低[15]。Cagli等[16]研究发现CAPE对I/R诱导的CAT和GSH-Px活性变化无影响。文献[17]报道，CAPE对ISO诱导的心肌损伤大鼠的SOD和CAT酶活性无影响。本研究中，CAPE对ISO损伤心肌组织的SOD、CAT和GSH-Px酶活性无明显改善，而CAPE的衍生物CAPE-NO2对这3种抗氧化酶活性有显著提高作用，表明CAPE-NO2提升机体抗过氧化损伤活性强于CAPE。CAPE-NO2增强3种抗氧化酶活性的作用和心肌梗死灶面积降低的结果是一致的，因此有理由认为，这种增强酶活性对抗氧自由基损伤的作用可能是CAPE-NO2改善心肌缺血损伤的原因之一。
MI急性期诱导一氧化氮合酶(iNOS)表达，心脏中NO产生增加[18]。文献[19]报道，β-受体激动剂刺激iNOS上调，显著增加NO产生，这导致了硝化应激，产生了具有强氧化性的分子过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。有研究发现CAPE能显著降低由I/R诱导的NO升高[16]。本实验中，CAPE-NO2预处理显著降低ISO诱导的心肌损伤组织NO的升高，且作用比CAPE强，可能是由于CAPE-NO2提高抗氧化酶活性，阻止过氧化物产生和下游过氧亚硝基阴离子形成的原因。
综上所述，CAPE-NO2对ISO诱导的大鼠心肌缺血损伤发挥保护作用，可能是通过提高抗氧化酶活性，阻止氧化应激和硝化应激的发生来减少心肌损伤。
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