大肠埃希菌(Escherichia coli)是临床常见致病菌,其分离率在革兰阴性菌中居首位,也是生物膜感染的常见病原菌。细菌生物膜是细菌黏附于非生物或生物表面,将其包裹在自身分泌物中所形成的一种具有立体结构的细胞群落,临床上80%的感染都和生物膜有关[1, 2],形成生物膜的细菌具有高度的耐药性并能够逃避免疫系统的攻击[3],给临床治疗带来极大困难[4]。前期研究发现,亚抑菌浓度头孢他啶能够显著抑制临床分离大肠埃希菌生物膜的形成[5]。前期研究中我们选择抑制作用明显但是不影响细菌生长的1/4最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)作为实验浓度,但是由于临床分离细菌的MIC差别较大,1/4 MIC的药物浓度差别也很大。而了解药物在抑制细菌生物膜形成过程中的浓度变化可以为研究其抑制生物膜机制提供有益的数据支持。因此,本研究以前期研究发现的对头孢他啶耐药的临床分离株E46为研究对象,分析亚抑菌浓度头孢他啶对其生物膜形成的影响,采用PCR检测E46超广谱内酰胺酶(ESBLs)相关基因的表达,并通过高效液相色谱法(HPLC)分析头孢他啶在抑制细菌生物膜过程中的浓度变化,从而探究大肠埃希菌的耐药机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验菌株及来源E. coli 46(E46)来自第三军医大学西南医院住院患者的临床送检标本,并采用BBL Crystal Auto Reader快速细菌自动鉴定仪(美国)进行鉴定,E coli实验室菌株ATCC25922为西南医院国家药物临床试验机构保存菌株。
1.1.2 药品与试剂头孢他啶、氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因、亚胺培南、美罗培南购自美国Sigma公司;头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素、氨曲南、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟、妥布霉素、阿米卡星购自中国食品药品检定研究院。M-H琼脂、胰蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司。细菌基因组DNA提取试剂盒和琼脂糖购自北京天根公司;引物由Invitrogen 公司合成;2×Es Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。结晶紫购自美国Sigma公司,三氯乙酸购自Aladdin公司;磷酸二氢钾为分析纯;乙腈、甲醇为色谱纯。
1.1.3 主要设备电子天平(Sartorius公司,BP221D型);多点接种仪(日本Sakuma公司);酶标仪(Thermo公司,美国);1200系列高效液相色谱系统(美国Agilent公司);1100系列VWD检测器(美国Agilent公司);色谱柱(迪马公司,Diamonsil C18,250 mm×4.6 mm,5 μm);PCR扩增仪、电泳仪和凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。
1.2 实验方法 1.2.1 抗菌药物对临床分离株E46 MIC值测定采用标准琼脂平板倍比稀释法测定抗菌药物对临床分 离株E46的MIC值。大肠埃希菌E46划线接种于M-H 琼脂平板,37 ℃培养过夜。挑取单菌落至灭菌生理盐水稀释校正为0.5 McFarland单位(约108 CFU/mL)。以多点接种仪将1~2 μL菌液接种至含药物的M-H琼脂平板,37 ℃孵育18 h观察结果。以能够完全抑制细菌生长的最低药物浓度为该药物对细菌的MIC。MIC结果根据美国国家临床实验室标准委员会(CLSI,2010) 标准判读。E. coli菌株ATCC25922作为药敏质控菌株。
1.2.2 E46 ESBLs相关基因的检测针对国内常见的ESBLs基因类型,采用Genne Tool软件及参考文献[6]设计引物(表 1)。基因组DNA的提取按照细菌 基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。PCR反应体系(20 μL):2×Es Taq Master Mix 10 μL,引物各0.3 μL,DNA 0.4 μL,ddH2O 9 μL。PCR反应条件:94 ℃,5 min→94 ℃,30 s→退火(表 1),30 s→ 72℃,30 s×35个循环→72 ℃,10 min。PCR反应产物以1%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 μg/mL)电泳,上样10 μL,电压5 V/cm×30 min,以凝胶成像系统成像并观察结果。
基因 | 序列(5′→3′) | 引物长度 | 退火条件 |
TEM | F:CATTTCCGTGTCGCCCTTATTCR:CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC | 800 bp | 52 ℃ 30 s |
SHV | F:AGCCGCTTGAGCAAATTAAACR:ATCCCGCAGATAAATCACCAC | 713 bp | 52 ℃ 30 s |
GES | F:AGTCGGCTAGACCGGAAAGR:TTTGTCCGTGCTCAGGAT | 399 bp | 52 ℃ 30 s |
PER | F:GCTCCGATAATGAAAGCGTR:TTCGGCTTGACTCGGCTGA | 520 bp | 52 ℃ 30 s |
VEB | F:CATTTCCCGATGCAAAGCGTR:CGAAGTTTCTTTGGACTCTG | 648 bp | 52 ℃ 30 s |
OXA-1 | F:GGCACCAGATTCAACTTTCAAGR:GACCCCAAGTTTCCTGTAAGTG | 564 bp | 52 ℃ 30 s |
CTX-M group Ⅰ a | F:GACGATGTCACTGGCTGAGCR:AGCCGCCGACGCTAATACA | 499 bp | 55 ℃ 30 s |
CTX-M group Ⅳ b | F:GCTGGAGAAAAGCAGCGGAGR:GTAAGCTGACGCAACGTCTG | 474 bp | 62 ℃ 30 s |
ampC | F:TAAACACCACATATGTTCCGR:ACTTACTTCAACTCGCGACG | 663 bp | 50 ℃ 1 min |
a:CTX-M group Ⅰ包括CTX-M-1, 3, 10 to 12, 15 (UOE-1), 22, 23, 28, 29和30;b:CTX-M group Ⅳ包括CTX-M-9, 13, 14, 16 to 19, 21, 27和Toho-2; F:正义链;R:反义链 |
采用96孔板结晶紫染色法[7, 8]。具体方法为:E46在LB琼脂平板37 ℃培养过夜,挑单菌落至10 mL LB培养液中,37 ℃恒温培养过夜,以比浊法将过夜培养菌液稀释至0.5 McFarland单位(约108CFU/mL),转移入96孔平底细胞培养板,每孔体积200 μL,实验分为6组,分别为空白对照组、CAZ组(1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)。37 ℃恒温培养24 h后,小心移除培养液,以每孔200 μL PBS缓冲液轻柔冲洗2次,晾干后,以1%结晶紫溶液(每孔200 μL)染色15 min,移除结晶紫溶液,水洗3次,再次晾干。24 h后每孔加入100 μL 30%醋酸溶液,小心吹打溶液以完全溶解染 色液,于590 nm 处进行光密度检测。
1.2.4 HPLC法测定LB中CAZ的浓度 1.2.4.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil反相C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-含0.05 mol/L 磷酸二氢钾缓冲盐溶液(pH值调为2.5,体积比10.4 ∶89.6),流速为1.2 mL/min,检测波长:254 nm,柱温:30 ℃,进样体积:20 μL。
1.2.4.2 药物在LB培养液中标准曲线的建立精密称取CAZ 20.00 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇 ∶水(8 ∶2)定容至刻度,备用;从CAZ对照液(2 mg/mL)中取出40 μL加入到960 μL LB培养液中,混匀30 s,即为80 μg/mL CAZ的LB溶液,按此法配制一系列标准浓度的CAZ溶液:80、40、20、10、5、2、1、0.5 μg/mL。上述标准液各取0.4 mL加入0.16 mL 10%三氯乙酸溶液,振荡混匀2 min,13 000 r/min离心5min,转上清液至进样瓶中,取20 μL进样。以峰面积对样品浓度作回归计算,绘制标准曲线。
1.2.4.3 药物样品及对照品溶液的制备将过夜培养的E46菌液稀释1 000倍,再向其中加入CAZ(终浓度为1/4 MIC),对照组不加菌;将样品、对照品溶液于37 ℃恒温振荡培养,分别于0、2、4、6 h取出菌液离心(12 000 r/min,10 min),取0.4 mL上清液与0.16 mL 10%三氯乙酸溶液振荡混匀2 min,13 000 r/min离心5 min,转上清液至进样瓶,取20 μL进样。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对生物膜形成的差异进行独立样本t检验。
2 结果 2.1 抗生素对临床分离株E46 MIC值测定结果显示,临床分离株E46仅对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、呋喃妥因敏感,对头孢吡肟、妥布霉素呈中度敏感性,而对头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、庆大霉素、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星呈高度耐药性。其中,头孢他啶对E46的MIC为256 μg/mL。
2.2 E46 ESBLs相关基因的检测PCR检测结果显示,临床分离株E46仅有TEM和CTX-M group Ⅰ基因扩增阳性,未扩增出其他ESBLs耐药基因。blaCTX-M group经测序鉴定为CTX-M-15。
2.3 亚抑菌浓度CAZ影响E46生物膜形成的剂量-效应分析结果如图 1所示,CAZ在1/16~1/2 MIC范围内呈剂量依赖性抑制E46生物膜的形成,其中1/2 MIC CAZ对生物膜的抑制作用最强,但是1/2 MIC CAZ对E46的生长有抑制作用,因此在后续的实验中均选用1/4 MIC CAZ进行研究。
2.4 HPLC法测定LB中CAZ的浓度LB中CAZ浓度在0.5~80 μg/mL的范围内线性回归方程为Y=15.164 96X+10.051 48,相关系数r=0.999 9。将各时间点样品的峰面积代入回归方程,换算出CAZ的浓度(图 2)。结果显示,1/4 MIC(64 μg/mL)CAZ加入LB培养液中发生了部分降解,在LB和E46培养液中分别降解了12.32%和14.38%。 随着培养时间的延长,在不含E46的培养液中,CAZ的浓度几乎保持不变;而在含有E46的培养液中,CAZ的浓度逐渐降低,6 h后降解了60.67%。
3 讨论根据课题组前期实验结果,临床分离的大肠杆菌对临床常规使用的抗菌药物具有较高的耐药性,并且可以形成生物膜,且1/4MIC抗菌药物可以抑制生物膜的形成[5]。为进一步探索其抑制细菌生物膜形成的机制,我们在分析细菌的耐药背景后采用高效液相色谱法对菌株的耐药基因和头孢他啶的作用浓度进行分析。本研究结果显示大肠埃希菌E46携带TEM和CTX-M-15型酶,由于ESBLs可以降解3代头孢菌素等抗菌药物[9, 10],提示头孢他啶在与E46作用过程中的浓度会有较大的变化。
实验过程中以CAZ的浓度为自变量(X),峰面积为因变量(Y),分别建立了CAZ在不含E46的LB溶液中的标准曲线及回归方程:Y=15.164 96X+10.051 48(r=0.999 9),CAZ在含有E46的LB溶液中的标准曲线及回归方程:Y=11.482 29X+8.333 89(r=0.998 5),由于细菌合成ESBLs使抗菌药物降解,在含有细菌的溶液中建立的标准曲线,相关系数较低,因此本实验只采用不含E46的LB溶液中的标准曲线及回归方程。结果显示LB培养液中,头孢他啶比较稳定,随着时间的延长,头孢他啶的浓度变化不大。而在含有大肠埃希菌临床分离株E46的培养基中发现,随着培养时间的延长,头孢他啶的浓度逐渐降低,随着时间的延长,细菌浓度增加,使得ESBLs表达也增加,细菌浓度的增加使抗菌药物浓度降低更显著。
根据实验发现在亚抑菌浓度头孢他啶抑制细菌生物膜形成过程中,头孢他啶快速降解但却依然可以抑制生物膜的形成,同时实验中发现其抑制作用存在明显的量效关系,提示头孢他啶的降解虽不能使抑制作用消失,但是可以明显抑制其效能,头孢他啶抑制细菌生物膜形成可能作用于生物膜形成的整个过程。头孢他啶是临床常用的抗菌药物,研究发现在发挥其抗菌作用的同时,可以明显抑制生物膜的形成,对于耐药的菌株也具有相同作用。有研究报道其亚抑菌浓度对铜绿假单胞菌具有类似的作用[11, 12]。因此,在深入研究其抑制生物膜形成机制的同时应该确定这种作用是否在其他菌种中存在,为其在临床上治疗生物膜的相关感染提供理论依据。
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