间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于多能干细胞,可被定向诱导分化为脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞及软骨细胞等。MSCs被认为是骨组织工程的理想种子细胞之一,在临床治疗骨缺损及骨不连接等疾病中有巨大潜能[1];如何有效地促进MSCs成骨分化是目前骨组织工程的主要研究热点之一。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)属于转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,对骨骼的发育和成年骨缺损修复过程有重要作用[2]。BMP9是目前诱导MSCs成骨分化能力最强的BMPs[3],但其诱导MSCs成骨分化的具体机制 还不清楚。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是一种重要的抑癌基因,其主要功能是调节PI3K/Akt信号通路,阻止细胞过度增殖,在多种肿瘤细胞中存在缺失或突变[4]。PTEN的缺失导致骨密度增加,这一作用可能与PI3K/Akt活性增加有关[5]。PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化是否具有调节作用尚不清楚。因此,本研究探讨BMP9诱导MSCs成骨分化与PTEN的关系,并初步分析PTEN调节BMP9诱导MSCs成骨分化的可能机制,以期为进一步研究BMP9诱导MSCs成骨分化的机制及影响因素提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞培养及试剂小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)为课题组提取的原代细胞,C3H10T1/2、C2C12和MC3T3-E1等细胞株均购自American Type Culture Collection(ATCC)公司。细胞培养条件为5% CO2及37 ℃;采用DMEM培养基(高糖,含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L)。PTEN抑制剂VO-OHpic trihydrate(VO)购自Sigma-Aldrich公司。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。本实验所用抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。
1.2 重组腺病毒的构建本研究所用重组腺病毒均采用AdEasy系统构建[6]。用PCR扩增目的基因编码序列并克隆到穿梭质粒。将穿梭质粒线性化后与BJ5183-AdEasy细菌重组,将重组正确的质粒线性化并转染到HEK-293细胞(human embryonic kidney-293)进行病毒包装,得到目的基因编码序列的重组腺病毒。即GFP重组腺病毒(AdGFP)、BMP9重组腺病毒(AdBMP9)和PTEN重组腺病毒(AdPTEN)。AdGFP作为重组腺病毒对照。
1.3 细胞免疫化学实验调整好细胞浓度,制成细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定30 min,PBS充分冲洗、晾干,3% H2O2室温孵 育20 min,PBS冲洗,滴加30 μL山羊血清封闭液,室温孵育30 min后倾去,滴加1 ∶100稀释的一抗30 μL/片 (PBS稀释),置湿盒内4 ℃过夜,滴加1 ∶200稀释的生物素化二抗30 μL/片(PBS稀释),37 ℃湿盒内温育 30 min,加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素30 μL/片,37 ℃孵育30 min,DAB显色(除滴加山羊血清封闭液外,每步反应前均用PBS冲洗5 min×3次),镜下观察显色后充分水洗,苏木精复染,常规脱水、透明、中性树胶封片。
1.4 实验分组及腺病毒滴度测定MEFs细胞分为对照组、PTEN抑制剂组(VO 4 nmol/L 和16 nmol/L)、BMP9组及BMP9合并不同浓度PTEN抑制剂组。对照组用Ad-GFP处理并同时给予与PTEN抑制剂体积相同的DMSO。PTEN抑制剂组用不同浓度的VO合并Ad-GFP处理细胞。BMP9组用Ad-BMP9感染细胞并同时给予与PTEN抑制剂体积相同的DMSO。BMP9合并PTEN抑制剂组为Ad-BMP9感染细胞并同时给予不同浓度的PTEN抑制剂。实验前先对每种腺病毒在MEFs中的滴度进行测定(相对滴度)。先将MEFs按实验要求种于24孔板,待细胞贴壁后,分别加入0.5、1、2、4、8、16 μL病毒液于孔板中;24 h后,进行荧光观察,确定BMP9(高、中、低)感染效率所需的腺病毒液的体积(图 1)。最后,通过预试确定实验所需的最佳腺病毒感染率。
1.5 RT-PCR检测将处于指数生长状态的细胞均匀种接于T25培养瓶,待细胞贴壁后按实验设计加入相应的处理因素,并用含1%胎牛血清的完全培养基培养,于培养9、11 d采用TRIzol法提取细胞总RNA,根据试剂盒说明书逆转录反应制备cDNA。通过RT-PCR检测相关晚期成骨指标基因表达情况。每组实验重复3次。
1.6 Western blot检测将生长状态良好的细胞均匀种接于6孔板,待细胞贴壁后加入相应处理因素,常规方法于不同时间点提取细胞总蛋白。采用BCA法测定提取的总蛋白浓度,根据测得蛋白浓度,用常规方法进行Western blot实验。最后,利用ECL化学发光法显影,然后使用凝胶成像仪成像。每组实验重复3次。
1.7 ALP活性测定将细胞种于24孔板,细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素,于第5天和第7天参照文献[3, 7]测定ALP活性,具体操作按试剂盒说明进行。每组实验重复3次。
1.8 茜素红染色检测钙盐沉积将细胞种于24孔板,细胞贴壁后按分组加入相应处理因素,于第20天参照文献[8]进行茜素红染色。每组实验重复3次。
1.9 报告质粒检测实验将细胞种于T25培养瓶,待细胞贴壁后用Lipofectamine转染2 μg BMPR-Smad报告质粒(p12xSBE-Luc)[9]。16 h后,将细胞消化并重新种于24孔板,细 胞贴壁后加入相应处理因素。24 h后裂解细胞,按试剂盒操作说明测定荧光素酶活性。另用BCA法测定蛋白浓度,用于校正荧光素酶活性。每组实验重复3次。
1.10 统计学分析计量数据以x±s表示,采用Office软件对组间差异行t检验。
2 结果 2.1 BMP9抑制PTEN在MEFs中表达定量PCR检测结果显示,在MEFs、C3H10T1/2、C2C12和MC3T3-E1等细胞中均能检测到内源性PTEN表达(图 2A);同时,PCR和Western blot检测结果表明,在MEFs中BMP9明显抑制PTEN表达(图 2B、C);细胞免疫化学染色结果也显示BMP9能明显抑制PTEN的表达水平(图 3)。提示下调PTEN表达很可能与BMP9诱导MEFs成骨分化有关。
2.2 PTEN影响BMP9在MEFs中诱导ALP活性增加ALP染色检测显示,在MEFs中抑制PTEN能促进BMP9诱导ALP活性增加(图 4A);外源性过表达PTEN则抑制BMP9诱导ALP活性增加(图 4B)。同时,Western blot验证BMP9和PTEN重组腺病毒(图 4C、D)。提示,PTEN在BMP9诱导MEFs骨向分化过程中可能具有重要作用。
2.3 抑制PTEN促进BMP9诱导MEFs骨向分化抑制PTEN不仅增强BMP9在MEFs中诱导OCN表达(图 5),同时也明显促进BMP9在MEFs诱导钙盐沉积(图 6)。提示,抑制PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化具有明显促进作用。
2.4 抑制PTEN促进BMP9对BMPs/Smads信号的活化抑制PTEN能明显增加BMP9诱导的BMPR-Smad报告质粒转录活性(图 7A)。Western blot结果显示,在处理24、48 h后,抑制PTEN均明显提高BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化水平(图 7B)。提示抑制PTEN促进BMP9诱导MEFs成骨分化可能与增强BMPs/Smads信号的转导活性有关。
3 讨论组织工程骨是治疗骨不连接与骨缺损等疾病的理想材料。MSCs具有多向分化潜能,是骨组织工程的理想种子细胞。如何有效促进MSCs成骨分化是骨组织工程目前的研究热点之一[8]。BMP9是目前已知诱导MSCs成骨分化能力最强的因子之一,在骨组织工程中具有很好的应用前景。本研究发现,BMP9能抑制PTEN在MSCs中表达,并且抑制PTEN能明显促进BMP9诱导MSCs成骨分化,这种作用可能与增强BMPs/Smads信号转导有关。
BMPs除通过经典的BMP/Smad信号通路实现对相应生理过程调节外,也可通过非经典的BMP/Smad信号通路对相应的功能进行调节,如MAPKs和PI3K/Akt等[10, 11]。BMPs与受体(BMPⅠ型和Ⅱ型受体)结合后,使下游成骨性Smad1/5/8磷酸化,然后与Smad4形成复合物并转位入核,调节下游靶相关基因表达,如Runx2和Dlx-5等[12, 13]。BMP9是诱导MSCs成骨分化能力最强的BMPs成员[3]。因此,增强BMP9诱导干细胞成骨分化的能力,对于骨缺损、骨不连接及骨折等疾病的治疗具有重要意义,但BMP9诱导干细胞成骨分化的详细机制仍不十分清楚。
PTEN作为一种抑癌基因,其主要功能是负性调节PI3K/Akt信号[4],其缺失或突变能导致PI3K/Akt信号过度激活,使细胞增殖失控从而导致肿瘤发生。除与肿瘤有关外,PTEN也与骨代谢有关,机制可能与其调节PI3K/Akt信号活性有关[5]。PI3K/Akt信号在BMP9诱导干细胞成骨分化过程中具有重要作用[11],而PTEN又能调节PI3K/Akt信号。因此,PTEN可能对BMP9诱导MSCs成骨分化具有调节作用。
干细胞成骨分化受多种因素调控,过程复杂。但可通过相应的标志物对过程进行分析,如:Runx2、Dlx-5和Osterx 等转录调节因子,ALP、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和钙盐沉积等[12, 13]。本研究发现,PTEN在多种MSCs中均有表达,BMP9能抑制PTEN在MEFs中表达,提示PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化过程可能具有重要调节作用。MEFs是一种常用的MSCs,课题组前期研究表明BMP9能诱导MEFs成骨分化[14],且MEFs对BMP9诱导的反应要强于C3H10T1/2细胞,所以本研究选用MEFs进行实验。结果显示,外源性过表达PTEN明显抑制BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但抑制PTEN却促进BMP9的这种作用;同样,抑制PTEN促进BMP9在MEFs诱导OCN表达以及钙盐沉积。结果与文献报一致,即PTEN缺失能增加骨密度[5]。提示PTEN确实对BMP9诱导MEFs成骨分化具有调节作用。机制分析表明,抑制PTEN明显增强BMP9诱导的BMPs/Smads报告质粒转录活性,并使Smad1/5/8磷酸化水平增加。提示,PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化的调节很可能与经典的BMPs/Smads信号有关,但具体机制尚不清楚。
本研究结果表明,抑制PTEN可能是BMP9促进MSCs成骨分化的重要途径之一,PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化可能具有负性调节作用,机制可能与影响BMPs/Smads信号的转导活性有关。虽然本研究发 现抑制PTEN可以促进BMP9诱导MEFs成骨分化,但详细机制还不清楚;课题组将进一步通过沉默PTEN等多种方法分析PTEN调节这一过程的可能分子机制。
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