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PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用
伍秋香, 任春美, 陈振华, 陈前昭, 袁霜雪, 王东旭, 曾于桦, 李洋, 邵英, 黄军, 何百成    
400016 重庆,重庆医科大学药理学教研室,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室
摘要目的 研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制。 方法 采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达,分析在MEFs中BMP9对PTEN表达的影响。采用组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,PCR检测OPN和OCN的表达水平,茜素红染色检测钙盐沉积,分析PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化的影响;利用荧光素酶报告质粒和蛋白印迹等方法分析PTEN对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)/Smads信号转导的影响。 结果 PTEN在几种常见MSCs中均有表达;BMP9在MEFs中明显抑制PTEN的表达。抑制PTEN能促进BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但过表达PTEN对BMP9诱导MEFs的ALP活性有明显抑制作用。抑制PTEN明显促进BMP9在MEFs细胞中诱导的OCN表达,并增强钙盐沉积。报告质粒分析结果显示,抑制PTEN能明显增强BMPR-Smad报告质粒的转录活性,并增加Smad1/5/8的磷酸化水平。 结论 下调PTEN表达可能是BMP9诱导MEFs成骨分化重要途径之一,其机制可能与促进BMPs/Smads信号转导有关。
关键词骨形态发生蛋白9     PTEN     小鼠胚胎成纤维细胞     成骨分化     BMPs/Smads    
Role of PTEN in bone morphogenetic protein 9 induced osteogenic differentiation in mouse embryonic fibroblasts
Wu Qiuxiang, Ren Chunmei, Chen Zhenhua, Cheng Qianzhao, Yuan Shuangxue, Wang Dongxu, Zeng Yuhua, Li Yang, Shao Ying, Huang Jun, He Baicheng     
Department of Pharmacology, Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81372120).
Corresponding author: He Baicheng, E-mail: hebaicheng99@yahoo.com
Abstract: Objective To determine the effect of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) on bone morphogenetic protein 9 (BMP9) induced osteogenic differentiation in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and investigate the possible molecular mechanism. Methods Real-time PCR was employed to detect the endogenous expression of PTEN in mesenchymal stem cells (MSCs), and the effect of BMP9 on the expression of PTEN in the MEFs. Histochemical staining was used to assay the activity of alkaline phosphatase (ALP), PCR to detect the expression of osteopontin (OPN) and osteocalcin (OCN) induced by BMP9 in MEFs, and Alizarin Red S staining to detect the effect of PTEN on BMP9 induced matrix mineralization. Finally, BMPR-Smad luciferase reporter and Western blot assay were employed to determine the effect of PTEN on BMPs/Smads signaling pathway. Results PTEN was expressed in MSCs, and BMP9 inhibited the expression of PTEN in MEFs. Exogenous expression of PTEN inhibited the enhanced ALP activity induced by BMP9, whereas over-expression of PTEN suppressed the induced activity enhancement. Inhibition of PTEN improved the BMP9-induced expression of OCN in MEFs and promoted matrix mineralization. PTEN inhibitor potentiated BMP9-induced activation of BMPs/Smads signaling and phosphorylation of Smad1/5/8 in MEFs. Conclusion Down-regulation of PTEN plays an important role in the promotion of osteogenic differentiation induced by BMP9 in MSCs, which may be mediated by enhancing BMPs/Smads signaling transduction initialized by BMP9.
Key words: bone morphogenetic protein 9     phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten     mouse embryonic fibroblasts     osteogenic differentiation     BMPs/Smads    

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于多能干细胞,可被定向诱导分化为脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞及软骨细胞等。MSCs被认为是骨组织工程的理想种子细胞之一,在临床治疗骨缺损及骨不连接等疾病中有巨大潜能[1];如何有效地促进MSCs成骨分化是目前骨组织工程的主要研究热点之一。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)属于转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,对骨骼的发育和成年骨缺损修复过程有重要作用[2]。BMP9是目前诱导MSCs成骨分化能力最强的BMPs[3],但其诱导MSCs成骨分化的具体机制 还不清楚。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是一种重要的抑癌基因,其主要功能是调节PI3K/Akt信号通路,阻止细胞过度增殖,在多种肿瘤细胞中存在缺失或突变[4]。PTEN的缺失导致骨密度增加,这一作用可能与PI3K/Akt活性增加有关[5]。PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化是否具有调节作用尚不清楚。因此,本研究探讨BMP9诱导MSCs成骨分化与PTEN的关系,并初步分析PTEN调节BMP9诱导MSCs成骨分化的可能机制,以期为进一步研究BMP9诱导MSCs成骨分化的机制及影响因素提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞培养及试剂

小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)为课题组提取的原代细胞,C3H10T1/2、C2C12和MC3T3-E1等细胞株均购自American Type Culture Collection(ATCC)公司。细胞培养条件为5% CO2及37 ℃;采用DMEM培养基(高糖,含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L)。PTEN抑制剂VO-OHpic trihydrate(VO)购自Sigma-Aldrich公司。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。本实验所用抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

1.2 重组腺病毒的构建

本研究所用重组腺病毒均采用AdEasy系统构建[6]。用PCR扩增目的基因编码序列并克隆到穿梭质粒。将穿梭质粒线性化后与BJ5183-AdEasy细菌重组,将重组正确的质粒线性化并转染到HEK-293细胞(human embryonic kidney-293)进行病毒包装,得到目的基因编码序列的重组腺病毒。即GFP重组腺病毒(AdGFP)、BMP9重组腺病毒(AdBMP9)和PTEN重组腺病毒(AdPTEN)。AdGFP作为重组腺病毒对照。

1.3 细胞免疫化学实验

调整好细胞浓度,制成细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定30 min,PBS充分冲洗、晾干,3% H2O2室温孵 育20 min,PBS冲洗,滴加30 μL山羊血清封闭液,室温孵育30 min后倾去,滴加1 ∶100稀释的一抗30 μL/片 (PBS稀释),置湿盒内4 ℃过夜,滴加1 ∶200稀释的生物素化二抗30 μL/片(PBS稀释),37 ℃湿盒内温育 30 min,加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素30 μL/片,37 ℃孵育30 min,DAB显色(除滴加山羊血清封闭液外,每步反应前均用PBS冲洗5 min×3次),镜下观察显色后充分水洗,苏木精复染,常规脱水、透明、中性树胶封片。

1.4 实验分组及腺病毒滴度测定

MEFs细胞分为对照组、PTEN抑制剂组(VO 4 nmol/L 和16 nmol/L)、BMP9组及BMP9合并不同浓度PTEN抑制剂组。对照组用Ad-GFP处理并同时给予与PTEN抑制剂体积相同的DMSO。PTEN抑制剂组用不同浓度的VO合并Ad-GFP处理细胞。BMP9组用Ad-BMP9感染细胞并同时给予与PTEN抑制剂体积相同的DMSO。BMP9合并PTEN抑制剂组为Ad-BMP9感染细胞并同时给予不同浓度的PTEN抑制剂。实验前先对每种腺病毒在MEFs中的滴度进行测定(相对滴度)。先将MEFs按实验要求种于24孔板,待细胞贴壁后,分别加入0.5、1、2、4、8、16 μL病毒液于孔板中;24 h后,进行荧光观察,确定BMP9(高、中、低)感染效率所需的腺病毒液的体积(图 1)。最后,通过预试确定实验所需的最佳腺病毒感染率。

图 1 荧光倒置显微镜确定AdBMP9的感染效率(×200)
1.5 RT-PCR检测

将处于指数生长状态的细胞均匀种接于T25培养瓶,待细胞贴壁后按实验设计加入相应的处理因素,并用含1%胎牛血清的完全培养基培养,于培养9、11 d采用TRIzol法提取细胞总RNA,根据试剂盒说明书逆转录反应制备cDNA。通过RT-PCR检测相关晚期成骨指标基因表达情况。每组实验重复3次。

1.6 Western blot检测

将生长状态良好的细胞均匀种接于6孔板,待细胞贴壁后加入相应处理因素,常规方法于不同时间点提取细胞总蛋白。采用BCA法测定提取的总蛋白浓度,根据测得蛋白浓度,用常规方法进行Western blot实验。最后,利用ECL化学发光法显影,然后使用凝胶成像仪成像。每组实验重复3次。

1.7 ALP活性测定

将细胞种于24孔板,细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素,于第5天和第7天参照文献[3, 7]测定ALP活性,具体操作按试剂盒说明进行。每组实验重复3次。

1.8 茜素红染色检测钙盐沉积

将细胞种于24孔板,细胞贴壁后按分组加入相应处理因素,于第20天参照文献[8]进行茜素红染色。每组实验重复3次。

1.9 报告质粒检测实验

将细胞种于T25培养瓶,待细胞贴壁后用Lipofectamine转染2 μg BMPR-Smad报告质粒(p12xSBE-Luc)[9]。16 h后,将细胞消化并重新种于24孔板,细 胞贴壁后加入相应处理因素。24 h后裂解细胞,按试剂盒操作说明测定荧光素酶活性。另用BCA法测定蛋白浓度,用于校正荧光素酶活性。每组实验重复3次。

1.10 统计学分析

计量数据以x±s表示,采用Office软件对组间差异行t检验。

2 结果 2.1 BMP9抑制PTEN在MEFs中表达

定量PCR检测结果显示,在MEFs、C3H10T1/2、C2C12和MC3T3-E1等细胞中均能检测到内源性PTEN表达(图 2A);同时,PCR和Western blot检测结果表明,在MEFs中BMP9明显抑制PTEN表达(图 2B、C);细胞免疫化学染色结果也显示BMP9能明显抑制PTEN的表达水平(图 3)。提示下调PTEN表达很可能与BMP9诱导MEFs成骨分化有关。

A:不同细胞中定量PCR检测PTEN的表达 1:MEFs;2:C3H10T1/2;3:C2C12;4:MC3T3-E1;B:定量PCR检测BMP9对PTEN表达的影响 1:对照组;2: BMP9(低);3: BMP9(中);4: BMP9(高) a: P<0.05,b: P<0.01,与对照组比较;C:Western blot检测BMP9对PTEN表达的影响 1:对照组; 2: BMP9(低);3: BMP9(中);4: BMP9(高) 图 2 PTEN在间充质干细胞中的内源性表达以及BMP9在 MEFs中对PTEN表达的影响
A:对照组;B:BMP9(低) 图 3 免疫组化观察BMP9在MEFs对PTEN表达的 影响 (S-P ×400)
2.2 PTEN影响BMP9在MEFs中诱导ALP活性增加

ALP染色检测显示,在MEFs中抑制PTEN能促进BMP9诱导ALP活性增加(图 4A);外源性过表达PTEN则抑制BMP9诱导ALP活性增加(图 4B)。同时,Western blot验证BMP9和PTEN重组腺病毒(图 4C、D)。提示,PTEN在BMP9诱导MEFs骨向分化过程中可能具有重要作用。

A: 抑制PTEN表达ALP染色分析 1:对照组;2:BMP9;3:VO 4 nmol/L组;4:VO 16 nmol/L组;5:VO 4 nmol/L+BMP9组;6:VO 16 nmol/L+BMP9组;B:过表达PTEN ALP 染色分析 1:对照组;2: BMP9组; 3: PTEN组; 4: BMP9+ PTEN组; C: Western blot检测BMP9的表达 1:对照组;2: BMP9重组腺病毒;D: Western blot检测PTEN的表达 1:对照组;2:PTEN重组腺病毒 图 4 PTEN对BMP9诱导MEFs中ALP活性增加的影响及 BMP9和PTEN重组腺病毒的功能验证
2.3 抑制PTEN促进BMP9诱导MEFs骨向分化

抑制PTEN不仅增强BMP9在MEFs中诱导OCN表达(图 5),同时也明显促进BMP9在MEFs诱导钙盐沉积(图 6)。提示,抑制PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化具有明显促进作用。

1:对照组;2: BMP9组;3:VO 4 nmol/L组; 4:VO 16 nmol/L组;5:VO 4 nmol/L+BMP9组; 6:VO 16 nmol/L +BMP9组 图 5 PCR分析PTEN抑制剂对BMP9在MEFs中诱导 OCN和OPN的影响
A:对照组; B: BMP9组;C:VO 4 nmol/L组;D:VO 16 nmol/L组;E:VO 4 nmol/L+BMP9组;F:VO 16 nmol/L+BMP9组 图 6 茜素红染色观察PTEN抑制剂对BMP9在MEFs中 诱导成骨标志物的影响(×100)
2.4 抑制PTEN促进BMP9对BMPs/Smads信号的活化

抑制PTEN能明显增加BMP9诱导的BMPR-Smad报告质粒转录活性(图 7A)。Western blot结果显示,在处理24、48 h后,抑制PTEN均明显提高BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化水平(图 7B)。提示抑制PTEN促进BMP9诱导MEFs成骨分化可能与增强BMPs/Smads信号的转导活性有关。

A: 报告质粒转录活性 a: P<0.05,b:P<0.01,与BMP9组比较;B:Western blot检测 1:对照组; 2: BMP9组; 3: VO 16 nmol/L组; 4:VO 16 nmol/L+BMP9组 图 7 报告质粒及Western blot分析不同时间点PTEN抑制剂 对BMP9诱导BMPs/Smads信号活化的影响
3 讨论

组织工程骨是治疗骨不连接与骨缺损等疾病的理想材料。MSCs具有多向分化潜能,是骨组织工程的理想种子细胞。如何有效促进MSCs成骨分化是骨组织工程目前的研究热点之一[8]。BMP9是目前已知诱导MSCs成骨分化能力最强的因子之一,在骨组织工程中具有很好的应用前景。本研究发现,BMP9能抑制PTEN在MSCs中表达,并且抑制PTEN能明显促进BMP9诱导MSCs成骨分化,这种作用可能与增强BMPs/Smads信号转导有关。

BMPs除通过经典的BMP/Smad信号通路实现对相应生理过程调节外,也可通过非经典的BMP/Smad信号通路对相应的功能进行调节,如MAPKs和PI3K/Akt等[10, 11]。BMPs与受体(BMPⅠ型和Ⅱ型受体)结合后,使下游成骨性Smad1/5/8磷酸化,然后与Smad4形成复合物并转位入核,调节下游靶相关基因表达,如Runx2和Dlx-5等[12, 13]。BMP9是诱导MSCs成骨分化能力最强的BMPs成员[3]。因此,增强BMP9诱导干细胞成骨分化的能力,对于骨缺损、骨不连接及骨折等疾病的治疗具有重要意义,但BMP9诱导干细胞成骨分化的详细机制仍不十分清楚。

PTEN作为一种抑癌基因,其主要功能是负性调节PI3K/Akt信号[4],其缺失或突变能导致PI3K/Akt信号过度激活,使细胞增殖失控从而导致肿瘤发生。除与肿瘤有关外,PTEN也与骨代谢有关,机制可能与其调节PI3K/Akt信号活性有关[5]。PI3K/Akt信号在BMP9诱导干细胞成骨分化过程中具有重要作用[11],而PTEN又能调节PI3K/Akt信号。因此,PTEN可能对BMP9诱导MSCs成骨分化具有调节作用。

干细胞成骨分化受多种因素调控,过程复杂。但可通过相应的标志物对过程进行分析,如:Runx2、Dlx-5和Osterx 等转录调节因子,ALP、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和钙盐沉积等[12, 13]。本研究发现,PTEN在多种MSCs中均有表达,BMP9能抑制PTEN在MEFs中表达,提示PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化过程可能具有重要调节作用。MEFs是一种常用的MSCs,课题组前期研究表明BMP9能诱导MEFs成骨分化[14],且MEFs对BMP9诱导的反应要强于C3H10T1/2细胞,所以本研究选用MEFs进行实验。结果显示,外源性过表达PTEN明显抑制BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但抑制PTEN却促进BMP9的这种作用;同样,抑制PTEN促进BMP9在MEFs诱导OCN表达以及钙盐沉积。结果与文献报一致,即PTEN缺失能增加骨密度[5]。提示PTEN确实对BMP9诱导MEFs成骨分化具有调节作用。机制分析表明,抑制PTEN明显增强BMP9诱导的BMPs/Smads报告质粒转录活性,并使Smad1/5/8磷酸化水平增加。提示,PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化的调节很可能与经典的BMPs/Smads信号有关,但具体机制尚不清楚。

本研究结果表明,抑制PTEN可能是BMP9促进MSCs成骨分化的重要途径之一,PTEN对BMP9诱导MSCs成骨分化可能具有负性调节作用,机制可能与影响BMPs/Smads信号的转导活性有关。虽然本研究发 现抑制PTEN可以促进BMP9诱导MEFs成骨分化,但详细机制还不清楚;课题组将进一步通过沉默PTEN等多种方法分析PTEN调节这一过程的可能分子机制。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201506036
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伍秋香,任春美,陈振华,陈前昭,袁霜雪,王东旭,曾于桦,李洋,邵英,黄军,何百成
Wu Qiuxiang, Ren Chunmei, Chen Zhenhua, Cheng Qianzhao, Yuan Shuangxue, Wang Dongxu, Zeng Yuhua, Li Yang, Shao Ying, Huang Jun, He Baicheng
PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用
Role of PTEN in bone morphogenetic protein 9 induced osteogenic differentiation in mouse embryonic fibroblasts
第三军医大学学报, 2016, 38(3): 264-269
J Third Mil Med Univ, 2016, 38(3): 264-269.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201506036

文章历史

收稿:2015-06-08
修回:2015-07-19

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