水杨酸苯酚贴膏是用于治疗脚部鸡眼的外用药^[1]。该药的质量标准收载于《国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》第10册，原质量标准中无有关物质的测定^[2]。水杨酸苯酚贴膏是由水杨酸、苯酚和基质组成^[3]，其中水杨酸是由苯酚合成，合成过程中主要采用了苯环的亲电取代反应，所以在合成的过程中也产生了其他杂质，主要有4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸及苯酚^[4]。《中国药典》2010版采用HPLC法对水杨酸中的4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸及苯酚三种杂质进行了测定^[5]。为了更好的控制水杨酸苯酚贴膏的质量，通过对水杨酸苯酚贴膏中的有关物质进行系统研究，建立了HPLC法测定有关物质4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸的方法^{[6, 7, 8]}，该法简便、专属性好，灵敏度高，可有效控制水杨酸苯酚贴膏的质量。

HP1100型高效液相色谱仪、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、UV检测器。水杨酸苯酚贴膏(自制)；4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸(中国药品生物制品检定所)；乙腈(天津四友精细化学品有限公司)为色谱纯、水为纯化水，其他试剂为分析纯。

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-2%冰乙酸溶液(20 ∶80)；检测波长为270 nm；进样量为10 μL；流速为1 mL/min。理论塔板数按4-羟基苯甲酸和4-羟 基间苯二甲酸峰计算，均应不低于2 000； RSD≤2.0%；分离度R≥2。

分别精密称取4-羟基苯甲酸和4-羟基间苯二甲酸适量，加流动相制成每1 mL含4-羟基苯甲酸5 μg和4-羟基间苯二甲酸2.5 μg的混合对照品溶液。

精密称取样品约0.4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL。称量，微热，振摇，使水杨酸溶解后，放冷至室温，称量，用流动相补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液备用。

精密取供试液20 mL，至50 mL容量瓶中，静置6 h，加入适量流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

精取供液20 mL，至50 ml容量瓶中，加入5 mol/L的盐酸溶液5 mL，静置6 h，加入适量5 mol/L的氢氧化钠溶液中和，加入适量流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

精供试液20 mL，至50 mL容量瓶中，加入5 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL，静置6 h，加入适量5 mol/L的盐酸溶液中和，加入适量流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

精取供试液20 mL，至50 mL容量瓶中，于90 ℃水浴锅中加热6 h，取出，放冷，加入适量流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

精取供液20 mL，至50 mL容量瓶中，加入30%的过氧化氢溶液2 mL，静置6 h，加入适量流动相稀释至刻度，摇匀，备用。

分别精密吸取上述5项下供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定、记录色谱图(图 1~5)。可见，本品在强酸、强碱、高温及氧化等各种条件下，水杨酸均有不同程度的降解反应，但是在各种破坏条件下产生的降解产物峰与4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸、苯酚和水杨酸峰均能达到良好分离。

图 1 对比供试品色谱图

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图 2 对比供试品强酸破坏色谱图

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图 3 对比供试品强碱破坏色谱图

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图 4 对比供试品高温破坏色谱图

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图 5 对比供试品氧化破坏色谱图

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分别精密称取4-羟基苯甲酸和4-羟基间苯二甲酸适量，加流动相制成每1 mL含4-羟基苯甲酸10 μg和4-羟基间苯二甲酸5 μg的混合对照品原液A。分别精密量取对照品原液A 1、3、5、7、9 mL，至10 mL量瓶中，加流动相稀释并定容至刻度，制成4-羟基苯甲酸浓度为1、3、5、7、9 μg/mL，4-羟基间苯二甲酸浓度为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μg/mL的混合液，将上述5份溶液按2.1的色谱条件进行测定，结果见表 1、2。

精密量取“2.2.1”的混合对照液1 mL，至100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，再依次逐级稀释，分取10 μL进样分析，4-羟基苯甲酸检测限(s/n=3)为4 ng/mL，定量限(s/n=10)为12 ng/mL；4-羟基间苯二甲酸检测限(s/n=3)为13 ng/mL，定量限(s/n=10)为51 ng/mL。

分别精密称取4-羟基苯甲酸和4-羟基间苯二甲酸适量，加流动相制成每1 mL含4-羟基苯甲酸25 μg和4-羟基间苯二甲酸12.5 μg的 混合对照品原液B。精密吸取1 mL混合对照品原液B 至5 mL量瓶，用流动相稀释定容至刻度线，制成每1 mL 含4-羟基苯甲酸5 μg和4-羟基间苯二甲酸2.5 μg的混合对照品溶液。

方法同“2.2.2”。

取本品约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品原液B 5 mL，精密加入流动相45 mL。称重，微热，振摇，使水杨酸溶解后，放冷至室温，称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液备用，即得。重复上述操作处理6个样品。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和回收率溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，测定结果见表 3、表 4。

由试验结果可知，6个供试品溶液的回收率均应在98%~102%之间，RSD≤2.0%，回收率良好。

取“2.2.1”项下的样品溶液，每隔3 h进样一次，测定结果如表 5。

取“2.2.1”项下的对照品溶液，连续进样6次，按峰面积计算RSD为0.9%，表明该方法精密度良好。

由上述实验结果可知：本检验方法适合进行4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸的测定。说明本方法能有效检测水杨酸苯酚贴膏有关物质。

按“2.2”项下方法配制对照品溶液和供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进行测定，测定结果见表 6。

标准限度：供试品溶液的色谱图中如有与对照品溶液中保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，4-羟基苯甲酸不得过0.1%，4-羟基间苯二甲酸不得过0.05%；其他单个杂质峰面积不得大于对照品溶液中4-羟基间苯二甲酸峰面积(0.05%)；各杂质峰面积的和不得大于对照品溶液中4-羟基苯甲酸峰面积的2倍(0.2%)。

使用乙腈-冰乙酸系统进行测定，可以有效改善主峰与杂质峰的分离效果，各峰之间的分离度均大于3，主成分峰的n均大于3 000。曾采用乙腈-2%冰乙酸溶液(20 ∶80)、(40 ∶60)、(30 ∶70)，最终综合多方因素考虑确定为(20 ∶80)。

水杨酸苯酚贴膏收载于《部颁标准》第10册，原质量标准中无有关物质的测定^[2]。水杨酸苯酚贴膏中杂质的含量应小于0.1％，杂质含量超过0.1％需要做毒理实验。2010版《中国药典》采用HPLC法只对水杨酸原料药中的4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸及苯酚三种杂质进行了测定^[5]。通过上述实验，采用HPLC法不仅测定了水杨酸苯酚贴膏中4-羟基苯甲酸、4-羟基间苯二甲酸含量，还能够测定水杨酸苯酚贴膏中其他杂质含量，为水杨酸苯酚贴膏制剂中有关杂质的控制提供了有效的检测方法，该法操作简便、专属性好，灵敏度高，可有效控制水杨酸苯酚贴膏质量。