2.402260 重庆，重庆市江津区中心医院肿瘤科；
3.646000 四川 泸州，四川医科大学附属第一医院肿瘤科
2.Department of Oncology, Jiangjin Central Hospital, Chongqing, 402260;
3.Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Sichuan Medical College, Luzhou Sichuan Province, 646000, China
miRNAs是一类微小的、内源性的、非编码的单链RNA，通过翻译抑制或mRNA降解来调节基因表达[1]。已经证实在较多实体肿瘤中一些miRNAs存在异常水平的表达，展示了其在诊断、治疗、预后判断等方面所起到的重要作用[2, 3, 4]。新近研究发现，miRNAs被识别为能参与调控肿瘤治疗及化疗耐受的关键基因[5]。Zhu等[6]证实了miRNA可通过调控MDR1/P-gp介导的药物外排途经参与多药耐药，随后miRNA参与耐药的一些其他可能机制被相继报道，比如细胞周期分布[7, 8]和细胞凋亡[9]的异常调节。Kovalchuk等[10]发现在乳腺癌MCF-7细胞中miR-451参与调节多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)的表达，但目前尚少有在结直肠癌中miR-451能否通过MDR1/P-gp途径参与多药耐药的相关研究报道。因此，本研究检测了miR-451及相关耐药蛋白在结直肠癌临床标本、耐药及敏感细胞中的表达差异，并进一步于体外研究miR-451表达水平与MDR1/P-gp途径介导的多药耐药的调控关系，探索miR-451在结直肠癌中对临床治疗的指导意义，为肿瘤化疗敏感性筛选提供有用的指标，以期为临床克服化疗耐药问题提供新的思路及理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂结直肠癌亲本及耐药细胞：HCT116，HCT116/L-OHP；LoVo，LoVo/adr 购于上海博谷生物科技公司，RPMI1640培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于浙江天杭生物科技公司，Hairpin-it miRNAs RT-PCR定量试剂盒、Custom qRT-PCR、miR-451模拟物(mimics)均购于上海吉玛公司，引物序列由上海生工生物公司合成，Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，MTT试剂盒购于北京康为世纪公司，鼠抗人P-gp单克隆抗体购于Merck公司，二抗羊抗鼠IgG及β-actin购于Sigma公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD Biosciences公司。
1.2 组织标本及细胞培养68例结直肠癌及癌旁组织均取自于永川医院胃肠外科患者术中，新鲜冻存于-80 ℃待用(临床标本使用经我院医学伦理委员会审查通过，取得患者知情同意)。所有患者术前未接受过放化疗，术后病理均为结直肠腺癌，癌旁组织为距肿瘤边缘5 cm以上切缘组织，病理证实为非癌组织。亲本细胞HCT116、LoVo及耐药细胞 HCT116/L-OHP、LoVo/adr均使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青链霉素的RPMI1640培养液，于37 ℃、5% CO2、90%湿度孵箱中培养，细胞贴壁。HCT116/L-OHP细胞培养基中奥沙利铂浓度从5 000 ng/mL 逐步提高至10 000 ng/mL，LoVo/adr细胞培养 基中阿霉素浓度从100 ng/mL逐步提高至200 ng/mL，以维持细胞耐药性。
1.3 定量PCR检测miR-451、MDR1 mRNA表达采用TRIzol试剂提取样本组织、对数期细胞总RNA，凝胶电泳检验总RNA完整性。使用Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quanitation Kit检测miR-451表达情况，包括逆转录反应和实时荧光定量PCR两部分。 20 μL 逆转录反应体系主要包括：dNTP 0.375 mmol/L，miRNA-RT primers 60 nmol/L，RNA Sample 2 μg等；反应程序：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。染料法定量PCR 20 μL反应体系主要包括：SYBR 10 μL，miRNA特异引物0.2 μmol/L，DNA拓扑聚合酶1U等；反应程序：95 ℃预变性3 min后，进行95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s共40个循环，以U6 snRNA作为内参，扩增反应在Bio-Rad公司CFX 96 Real-time PCR 检测系统中进行。按照Custom gene qRT-PCR Quantitation Kit试剂盒操作步骤检测目的细胞MDR1 mRNA表达。计算相对表达率采用2－△△Ct法(△Ct=Ct miRNA－Ct U6；△△Ct=△Ct样本－△Ct校正样品)。每个样本设3个复孔，复孔间Ct值差异≤0.5，否则重复该样本实验。引物序列如下：miR-451扩增引物正义链：5′-CGTCATCAAACCGTTACCATTAC-3′，反义链：5′-AAA-GGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3′，产物长度67 bp；U6 snRNA正义链：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反义链：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，产物长度 70 bp；MDR1正义链：5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′，反义链：5′-TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′，产物长度136 bp。
1.4 细胞转染参照Lipofectamine 2000试剂盒转染说明，2组耐药细胞胰酶消化后以3.5×105/孔分别接种至6孔板上，待其贴壁生长后每孔更换加入1.5 mL无血清培养基，分别取miR-451模拟物(mimics)及NC RNAs各150 pmol与5 μL脂质体Lipofectamine 2000混匀，最后分别转染HCT116/L与LoVo/adr耐药细胞，于37 ℃、5% CO2、90%湿度孵箱中孵育6 h 后，更换含10%胎牛血清培养基继续培养备用。
1.5 Western blot检测P-gp蛋白的表达采用RIPA裂解液裂解结直肠癌组织或目的细胞，BCA法计算样品蛋白浓度。选择8% SDS-PAGE分离样品蛋白60 μg，转膜至硝酸纤维滤膜，于室温摇床封闭2 h后，置于含鼠抗人P-gp单抗(1 ∶200)，鼠抗人β-actin单抗(1 ∶300)封闭液中，4 ℃孵育过夜。将膜置于含辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗中(1 ∶5 000),室温摇床孵育2 h后采用ECL Plus发光试剂显色。采用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值，以P-gp/β-actin比值反映P-gp蛋白相对表达水平。每组实验重复3次。
1.6 MTT检测转染细胞增殖情况转染miR-451 mimics(模拟物转染组)及NC RNAs(空白转染组)24 h后的各组耐药细胞以8.0×103/孔的密度接种至96孔板中，每孔200 μL终体积。待细胞贴壁后，按照以下药物浓度梯度，L-OHP:0、10、20、40、80、160、320 μg/mL；Adr:0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL，向转染后的HCT116/L-OHP，LoVo/adr对应加入L-OHP或Adr，每个浓度设3个复孔。加药后于孵箱中培养48 h，再向各孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，避光37 ℃孵育4 h后，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，避光振荡5 min。自动酶标仪于570 nm 波长处读取每孔的光密度值[D(570)]。细胞存活率=实验组D(570)值/空白组D(570)值×100%。根据各浓度点细胞存活率，BLISS法计算半数抑制浓度IC50，得出逆转指数RI=NC转染组细胞IC50值/mimics转染组IC50值。
1.7 FCM检测细胞凋亡情况接受miR-451 mimics、NC RNAs转染后的2组耐药细胞以3.5×105/孔密度接种于6孔板上，培养24 h。将终浓度为80 μg/mL的L-OHP，1.5 μg/mL的Adr(药物浓度依据IC50值，大于模拟物转染组IC50值，小于空白转染组IC50值)分别加入相应细胞孔内。培养48 h后收集细胞，200 μL缓冲液重悬细胞后加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL碘化丙啶，避光孵育15 min 后加入300 μL缓冲液待用。使用BD流式细胞仪分类计数。右上象限及右下象限分别代表晚期与早期凋亡细胞。
1.8 统计学方法使用IBM SPSS 19.0统计软件。实验数据以x±s表示，配对四格表资料关联性分析采用χ2检验或连续校正χ2检验，两组数据间比较使用t检验，两组以上数据比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 miR-451在结直肠癌与癌旁组织，亲本与耐药细胞中的mRNA差异性表达以U6为内参，荧光定量qPCR检测结果显示，miR-451在结直肠癌组织与癌旁组织中相对表达比率(2-△△Ct)分别为 (0.405±0.237)、(0.712±0.174)，与癌旁组织相比，miR-451在结直肠癌组织中呈低表达，平均下调43.12%(t=-8.60，P<0.01)。相较于亲本细胞，miR-451在结直肠癌耐药细胞HCT116/L和LoVo/adr中显著低表达：miR-451在HCT116/L中表达水平较HCT116中降低82%，在LoVo/adr中表达水平较LoVo中降低79%(P<0.01，图 1)。
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| a：P<0.01，与HCT116比较；b： P<0.01，与LoVo比较 图 1 MiR-451在结直肠癌亲本及耐药细胞中的差异表达 |
68例结直肠癌及癌旁组织中，miR-451水平在癌组织中较相对应癌旁组织中降低43.12%以上，即视该例miR-451低表达。统计得出，miR-451低表达与患者性别、年龄、肿瘤分级、淋巴转移或远处转移与否 无统计学差异，但其与临床分期存在相关性(r=-0.285，P=0.029，表 1)。miR-451与P-gp蛋白在68例结直肠癌组织中的表达情况见表 2，统计得出，结直肠癌组织中miR-451低表达与P-gp的阳性表达存在相关性(r=-0.404，P=0.002)。
| 临床特征 | n | miR-451表达水平 | P值 a | ||
| 低表达(例) | 未低表达(例) | ||||
| 性别 | 男 | 38 | 29 | 9 | 0.379 |
| 女 | 30 | 20 | 10 | ||
| 年龄(岁) | ≤57 | 36 | 26 | 10 | 0.975 |
| ＞57 | 32 | 23 | 9 | ||
| 分级 | G1 | 6 | 2 | 4 | 0.086 |
| G2 | 20 | 15 | 5 | ||
| G3 | 42 | 32 | 10 | ||
| 淋巴转移 | N0 | 8 | 4 | 4 | 0.139 |
| N1 | 60 | 45 | 15 | ||
| 远处转移 | M0 | 46 | 32 | 14 | 0.508 |
| M1 | 22 | 17 | 5 | ||
| 临床分期 | Ⅰ-Ⅱ | 31 | 18 | 13 | 0.029 |
| Ⅲ-Ⅳ | 37 | 31 | 6 | ||
| a：采用行列表方差分析计算P值 | |||||
| (例) | |||
| MiR-451表达情况 | P-gp表达情况 | 合计 | |
| - | ﹢ | ||
| 低表达 | 22 | 27 | 49 |
| 未低表达 | 17 | 2 | 19 |
| 合计 | 39 | 29 | 68 |
| 采用交叉表连续校正方差分析，χ2 =9.374;φ系数=-0.404；Cramer氏系数V=0.404；相关系数r=-0.404, P=0.002 | |||
HCT116/L、LoVo/adr耐药细胞在miR-451 mimics或NC RNAs转染48 h后，实时荧光定量qPCR检测发现，与空白转染组相比，模拟物转染组中两种耐药细胞MDR1 mRNA相对表达水平均下降(图 2A)。在无转染情况下，Western blot检测耐药及亲本细胞中P-gp蛋白的表达(图 2B)，在耐药细胞中P-gp高表达，而在亲本细胞中未检测到其表达。耐药细胞转染72 h后，Western blot检测两组细胞P-gp表达见图 2C。在“HCT116/L+mimics”组中P-gp相对表达量为(45±15)%，与空白转染组(85±13)%相比，下降约47% (t=3.85，P=0.018)；在“LoVo/adr+mimics”组中P-gp 相对表达量为(51±18)%，与空白转染组(89±7)%相比，下降约43%(t=3.45，P=0.026)。
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| A：MiR-451模拟物及空白转染2组耐药细胞后MDR1的差异表达 a：P=0.048，b：P=0.049，与空白转染组比较；B：P-gp蛋白在耐药与亲本细胞中的表达 1、2：HCT116/L、LoVo/adr； 3、4: HCT116、LoVo；C: 两组耐药细胞转染后P-gp的差异表达 图 2 MiR-451模拟物转染耐药细胞后MDR1与P-gp蛋白的差异性表达 |
MTT检测不同药物浓度时模拟物转染组与空白转染组耐药细胞的存活率，BLISS法得出转染后的半数抑制浓度IC50值。空白转染组L-OHP对HCT116/L的IC50为(138.04±2.21)μg/mL，模拟物转染组为(72.39±1.80)μg/mL (t=39.55,P<0.01)；Adr对LoVo/adr的半数抑制浓度在空白转染组及模拟物转染组分别为(2.09±0.14)与(1.36±0.19) (t=5.38,P=0.006)。计算得出逆转指数RI分别为：1.91(138.04/ 72.39)与1.54(2.09/1.36)。同时，HCT116/L、LoVo/adr细胞转染后，分别在L-OHP：80 μg/mL，Adr：1.5 μg/mL 条件下培养48 h后行流式细胞术比较凋亡情况(图 3)。空白转染组及模拟物转染组HCT116/L细胞凋亡率分别为 (38.81±5.27)%、(70.38±7.43)% (t=-6.0,P=0.004)；LoVo/adr细胞凋亡率分别为 (40.80±4.49)%，(67.88±5.53)%(t=-6.58,P=0.003)。
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| A:HCT116/L空白转染组；B：HCT116/L MiR-451模拟物转染组；C：LoVo/adr空白转染组；D：LoVo/adr MiR-451模拟物转染组；右上象限及右下象限分别代表晚期与早期凋亡细胞 图 3 FCM检测耐药细胞在空白及miR-451模拟物转染后凋亡率变化 |
miR-451的异常表达在结直肠癌细胞的增殖、侵袭等生物学行为方面发挥重要作用[11]，但是，其在MDR1/P-gp途径介导的多药耐药中的作用尚未知。因此，本研究从临床结直肠癌组织切入，以探寻在结直肠癌组织中miR-451表达情况与患者临床因素、耐药蛋白表达之间联系，并进一步研究在结直肠癌耐药细胞株中，人为提高miR-451表达水平，观察能否影响MDR1/P-gp表达而逆转耐药。
国外学者Bitarte等[12]在研究结直肠癌干细胞(CSCs)中的miRNA表达谱情况时发现，与亲代细胞相比，克隆细胞系中miR-451表达明显下降。miR-451表达增加能抑制细胞自我更新、肿瘤形成及对伊立替康的化疗耐受，他们识别出COX-2(环氧化酶-2)是miR-451的间接靶点，COX-2使Wnt信号通路活化，而Wnt是CSCs增长至关重要的因素,此外，提高miR-451表达能抑制耐药相关基因ABCB1的表达，进而使伊立替康化疗敏感。在本研究中，首先通过检测68例结直肠癌及癌旁组织中miR-451相对表达水平，证实了miR-451在结直肠癌组织中呈相对低水平表达。Wang等[13]研究发现在实体肿瘤非小细胞肺癌组织中，miR-451出现了下调，杨再林等[14]在慢性髓细胞白血病患者中也检测到了miR-451的下调。通过进一步检测在结直肠癌组织中P-gp是否表达，发现了在miR-451相对表达下降的样本中，更易检测到P-gp的阳性表达，统计得出其相关系数(r=-0.404)。当然，miR-451低表达与P-gp阳性表达相关程度并不是很高(r=-0.404)，且检测的组织样本量有限(n=68)。因此，还需进一步更大组织样本量的观察研究，同时也将继续观察该68例患者对化疗的敏感性及总生存期等。
与此同时，检测并证实了在两组结直肠癌耐药细胞株(HCT16/L,LoVo/adr)中，miR-451相对表达水平相对于亲本细胞降低了约80%，这在其他一些实体肿瘤耐药细胞中也有类似的发现[15, 16, 17]。以上在结直肠癌组织及细胞中miR-451表达水平差异的发现，推测miR-451在结直肠癌耐药细胞中可参与到MDR1/P-gp途径介导的多药耐药。在进一步研究中发现，miR-451 mimics转染HCT116/L、LoVo/adr两组耐药细胞以人为提高miR-451水平后，经检测，与NC RNAs转染组相比，其MDR1 mRNA与P-gp蛋白水平明显降低。同时检测比较细胞增殖、凋亡情况发现，转染miR-451 mimics的两组耐药细胞IC50值降低，凋亡率增高，即对化疗药物敏感性增加，达到了部分逆转耐药，逆转指数 RI分别为1.91和1.54。这一研究结果与Kovalchuk[10] 在乳腺癌MCF-7细胞中发现miR-451参与调节MDR1基因一致。由此可证明，miR-451在结直肠癌耐药细胞中，通过负性调控MDR1/P-gp途径影响耐药，当细胞中miR-451水平降低，这种负性调节作用减弱或消失，MDR1/P-gp表达增强，而提高miR-451水平，负性调控增强，MDR1/P-gp表达减弱，肿瘤细胞化疗敏感性增加。
综上所述，本研究证实了在结直肠癌组织中miR-451低表达与临床分期及P-gp阳性表达存在相关性。此外，在结直肠癌耐药细胞中miR-451部分逆转MDR1/P-gp途径介导的多药耐药。提示miR-451对预测患者化疗敏感性及评估预后方面有着重要的意义，其可能成为结直肠癌化疗中新的潜在治疗靶点，以克服多次化疗后出现的耐药问题。当然，导致多药耐药的机制不止MDR1/P-gp途径一种，miRNA与耐药的发生、发展机制尚需进一步研究明确。
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