腹泻严重影响着全球儿童的健康，每年有30亿~50亿人患急性腹泻，其中有150万~250万5岁以下的儿童死于腹泻及腹泻相关并发症。轮状病毒(rotavirus，RV)和诺如病毒(norovirus，NV)是造成儿童非细菌性胃肠炎的主要病原体，然而在轮状病毒疫苗使用之后，NV所致腹泻在儿童急性腹泻中担当着越来越重要的角色，成为引起儿童病毒性腹泻的第二大病原。据统计，NV每年可造成100万人次的住院和近20万5岁以下儿童的死亡[1]。目前我国大多数医院已将轮状病毒列为腹泻的常规检查病原，但未将NV列入其中，在不同地区NV的优势流行株存在差异，而且随着基因重组越来越多，NV的流行日趋复杂。因此，为了 解重庆地区NV的分子流行病学特点，本研究对2014年 重庆区域急性病毒性腹泻患儿的粪便标本进行收集并检测，为重庆区域NV感染提供更多的流行病学相关资料，也为NV相关腹泻预防和控制措施的制定提供有意义的参考依据。
1 材料与方法 1.1 标本材料以2014年1-12月在重庆医科大学附属儿童医院门诊检验科收集的临床诊断为急性病毒性胃肠炎的粪便标本511例为研究对象。标本纳入标准：①腹泻病程必须在2周以内；②粪便性状有改变以及每日排便次数在3次及以上；③镜检白细胞数每高倍视野小于10个[2]。排除标准：因其他系统感染长期使用抗生素而导致的腹泻。
1.2 主要试剂QIAamp核酸提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；SuperScript Ⅲ逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒和琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 RT-PCR用RT-PCR对NV进行检测和序列分析 QIAamp核酸提取试剂盒病毒提取NVRNA，用SuperScript 逆转录试剂盒逆转录为DNA，然后用RT-PCR试剂盒对NV衣壳蛋白区(capsid)进行扩增(分别用G1SKF/G1SKR为引物扩增NV GⅠ基因组，CoG2F/G2SKR为引物扩增NV GⅡ基因组,扩增区域见图 1，引物序列及反应条件见参考文献[3, 4])。再将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳对进行鉴定，对所有阳性PCR产物进行胶回收、纯化，然后送上海英骏公司测序。所测序列用NV基因分型工具(http://www.Rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)进行分型[5]，最后 使用MEGA 5.05构建进化树(遗传距离采用Kimura’s 2-parameter，置信度运用boot-strap法检验，重复1 000次)。
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| 图 1 RT-PCR对诺如病毒进行扩增示意图 |
整理上述检测分型成功的NV阳性的cDNA标本，再次用RT-PCR同时扩增部分RdRp区和capsid的部分基因片段(所用引物为JV12/G2SKR，扩增区域见图 1，引物序列及反应条件见参考文献[6])，扩增成功后再次测序，然后用NV基因分型工具分别按照RdRp区和capsid区进行基因分型，分型不一致则考虑基因重组，然后随机选取重组代表株用SimPlot再次进行重组鉴定。
1.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对各项实验数据进行分析，使用χ2检验对率进行比较。
2 结 果 2.1 NV检出率及患儿年龄分布511份标本纳入本研究(男性290例，女性221例，男女比例1.3 ∶1)，未检测出NV GI型，共检出NV GⅡ型 67例，NV总检出率13.1%(67/511)。NV阳性的患儿中，男性38例，女性29例，男女NV检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对511例患儿的年龄进行统计分析，年龄分布为1月龄至14岁，年龄中位数为12月龄。NV检测阳性率最高年龄组为7-12月龄，再对NV阳性的患儿按照年龄组进行统计分析，结果见表 1。
| 年龄 | 总例数 | NV阳性数 (例) | NV检出率 (%) | NV阳性病例累计 构成比(%) |
| 0～6月 | 97 | 7 | 7.2 | 10.4 |
| 7～12月 | 167 | 28 | 16.8 | 52.2 |
| 13～18月 | 108 | 15 | 13.9 | 74.6 |
| 19～24月 | 64 | 8 | 12.5 | 86.6 |
| 25～60月 | 64 | 8 | 12.5 | 98.5 |
| >60月 | 11 | 1 | 9.1 | 100.00 |
| 合计 | 511 | 67 | 13.1 | — |
对NV腹泻进行季节性分析，除2014年4月份外，其余各月份均有NV GⅡ型检出，NV以8-10月为检出高峰(图 2)，不同月份间NV检出率的差异具有统计学意义(χ2=58.583，P<0.05)。NV感染阳性的患儿均有腹泻表现，大便性状多为水样便，其中阳性患儿中36例(53.7%，36/67)患儿伴有呕吐，呕吐时间为1~3 d，呕吐多在进食后出现，呕吐物均为胃内容物，没有胆汁及咖啡色样的物质，另外有19例(28.4%，19/67)合并呼吸道症状(流涕、咳嗽、打喷嚏等)，此外还有7例(10.4%,7/67)患儿伴有发热，除1例为中热外，体温38.8 ℃，其余6例均为低热。
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| 图 2 2014年重庆地区儿童NV腹泻季节性分布 |
67例NV阳性均测序成功，然后按照衣壳区分型，共5种基因型，依次是GⅡ.4 Sydney 2012(62.7%，42/67)，GⅡ.3(11.9%，8/67)，GⅡ.17(11.9%，8/67)，GⅡ.6(10.4%，7/67)，GⅡ.14(3.0%，2/67)。将所测序列与GenBank下载的标本毒株(参考毒株为 AB901276、KF306213、AB919088、GU017903、KJ533134) 的参考序列一起构建系统进化树(图 3)，为了使基因树更简洁、形象，图 3中只列出了每种基因型的代表株，并未将全部67株加入进化树的构建。
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| 图 3 2014年重庆地区NV按capsid区分型构建系统进化树 |
67例阳性标本中59例同时扩增RdRp区和capsid区测序成功，另外8例因产物浓度低导致测序失败。所有59例标本同时按RdRp区和capsid区进行基因分 型，通过统计分析，包括5种基因型，依次是GⅡ.e/GⅡ.4 型42例、GⅡ.12/GⅡ.3型6例，GⅡ.7/GⅡ.14型2例、GⅡ.7/GⅡ.6型2例、GⅡ.17/GⅡ.17型7例。发现其中52例按这两种方法的分型结果不一致，则考虑为可疑重组株，为进一步确定是由于两种病毒混合感染还是因NV病毒重组引起，再次用SimPlot3.5.1软件对52例标本的基因序列进行重组鉴定，通过分析鉴定发现均为重组株(图 4中随机列出了4种 重组类型的代表株各1例CQNV0113/2014/CHN、CQNV0229/2014/CHN、CQNV0220/2014/CHN、 CQNV0249/2014/CHN)。 重组株在不同性别及年龄中分布如下表所示(表 2)。
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| A：CQNV0113/2014/CHN(GⅡ.e/GⅡ.4)； B：CQNV0229/2014/CHN(GⅡ.12/GⅡ.3)；C：CQNV0220/2014/CHN(GⅡ.7/GⅡ.14)；D：CQNV0249/2014/CHN(GⅡ.7/GⅡ.6) 图 4 用SimPlot对代表株的基因序列进行重组分析结果 |
| 重组型别 | 总数(例) | 性别 | 年龄组 | ||||||
| 男 | 女 | 0～6月 | 7～12月 | 13～18月 | 19～24月 | 25～60月 | >60月 | ||
| GⅡ.7/GⅡ.6 | 2 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| GⅡ.7/GⅡ.14 | 2 | 1 | 1 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| GⅡ.12/GⅡ.3 | 6 | 4 | 2 | 2 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| GⅡ.e/GⅡ.4 | 42 | 25 | 17 | 4 | 19 | 11 | 5 | 3 | 0 |
| 合计 | 52 | 31 | 21 | 7 | 24 | 12 | 6 | 3 | 0 |
本研究发现NV检出率为13.1%，比重庆2009年 (31.1%)及2012年(21.88%)、杭州2013年(17.9%)NV检出率低[7, 8, 9]。2012年衢州市(11.18%)及2012年 安徽(12.02%)检出率相近[10, 11]。NV检出率最低的是0-6月龄(7.2%)，NV检出率最高的年龄组为7-12月龄(16.8%)，与重庆(2009、2012年)、南京(2012年)[7, 8, 12]等全国大多数地区报道的高发年龄一致，可能与该年龄段婴儿的自身免疫体系还未发育完全，而从母体胎盘得到的自身保护性抗体又渐渐消失密切相关。对NV阳性的患儿进行年龄组统计，发现2岁以内婴幼儿占总阳性数的86.6%，提示2岁以内儿童仍是NV腹泻的主要群体，其中又以7-12月龄的婴幼儿为最重要的组成部分，因此以后在临床工作中需对该年龄段的儿童重点关注。
2014年以8-10月为检出高峰，本研究与之前同样在重庆地区2009年及2012年的调查研究NV的检出高峰相一致。本研究8-10月标本数量与其他季节比较相对较少，考虑到与夏季腹泻的患儿较少且多以细菌性腹泻为主，造成标本收集困难有关，但结合前几年重庆地区NV腹泻的流行病学资料，仍在一定程度上说明在重庆地区NV病毒的流行高峰季节为温度较 高的8-10月。同样也与上海地区(2009-2011年)[13] NV所致儿童腹泻的高发季节一致。严寒秋等[14]报道北京地区10月为NV感染高峰；日本、韩国及欧美等发达国家则以冬春季流行为主[15]。NV在不同地区的高发季节会有所差异，受所在地的温度、湿度、饮食结构及习惯、人群免疫力及新型变异株等影响，因此，应根据当地的流行特点对NV的流行来进行监控。
目前，全球对NV的分型主要针对capsid区进行分型，本研究检测发现NV GⅡ.4型依然是重庆地区的优势流行株，所占病例高达62.7%，与国内外报道一致[16, 17, 18]。本研究结果显示GⅡ.4只检测出GⅡ.4 Sydney 2012变异株。在我国前几年NV的流行株主要是 GⅡ.4 2006b 和 GⅡ.4 New Orleans 2009，但近两三年来GⅡ.4 Sydney也逐渐在我国上海、北京、香港等地区被检出，并逐渐成为流行优势株。在重庆地区GⅡ.4 Sydney首次在2012年冬季检出，并取代GⅡ.4_2006b成为2012年重庆地区冬季的优势流行株[19]。本研究发现，在2014年重庆地区的优势流行株依然是GⅡ.4 Sydney 2012，且未再检测出 GⅡ.4 2006b 和 GⅡ.4 New Orleans。GⅡ.3和GⅡ.6基因型既往在2008、2009、2011、2012年重庆地区均有检出过[7, 8, 20]，说明这两种基因型仍继续在重庆地区持续流行。本研究还检测出2例GⅡ.14，该基因型既往在重庆地区未曾有过报道，但在我国上海(2009年)、广西(2011年) 等地区曾报道过该基因型[13, 21]。本研究还检测出8例 GⅡ.17，该基因型在重庆地区同样为首次报道，靳淼等[22]曾在一起暴发性胃肠炎中检测报道过该基因型，在我国其他省市对该基因型的报道也很少。本研究可以看出，重庆地区2014年NV的流行以GⅡ.4 Sydney 2012为主，但其他流行基因型的变化更加复杂多样，复杂多变的基因型对我们NV防控措施的制定又是一个很大的挑战，所以还有待长期监测研究。
基因重组是NV进化的主要驱动力，也是NV基因多样性及产生暴发流行的最重要原因，通常NV基因重组是指RdRp区和capsid区分别属于不同的基因型，重组位点通常位于OFR1和OFR2的重叠区，第1例重组株由Jiang等[23]首先发现。目前全球不断有新的重组类型出现。NV基因重组最常发生在GⅡ.b/GⅡ.3、GⅡ.12/GⅡ.3、GⅡ.4/GⅡ.3之间[24]。我国常见的重组株为GⅡ.7/GⅡ.6和GⅡ.12/GⅡ.3。本研究重组鉴定发现2014年重庆地区NV基因重组的现象十分明显，GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012既往在重庆、上海等地区有过报道[8, 25]，GⅡ.12/GⅡ.3重组株在2011-2013年重庆地区也有过报道[19]，说明GⅡ.12/GⅡ.3 重组株近4年来仍在重庆地区持续流行，GⅡ.7/GⅡ.6重组株仅在2012年重庆地区有过1例报道[8]，本研究还在重庆地区发现一种新的病毒重组株 GⅡ.7/GⅡ.14。 本研究发现2014年重庆地区NV的流行以重组株 GⅡ.e/GⅡ.4 Sydney 2012型和GⅡ.12/GⅡ.3为主，且NV重组现象十分明显，说明流行日趋复杂，对NV疫苗的研制又提出了巨大的挑战。
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