2.400016 重庆,重庆医科大学:生物化学与药理学重点实验室
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是分布在骨髓、血液、脂肪、肌肉和真皮中的成体干细胞,近年来,因其具有高度自我更新能力[1]、多向分化潜能和取材方便等优点而成为骨折等骨科疾病细胞治疗和组织工程的理想种子细胞[2]。MSCs自我更新和定向分化的能力受到多种生长因子和信号通路情况的影响,而探究这些信号通路的作用机制对于MSCs在组织工程和再生医学中的应用将起到重要作用。骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)超家族的成员之一,具有多种生物学功能。骨形态形成蛋白9(BMP9)在体外可以诱导MSCs向成骨分化,是目前已经分离并鉴定的20余种BMPs中诱导MSCs成骨分化能力最强的因子[3, 4],具有潜在临床应用前景,但其诱导MSCs成骨分化的相关分子机制仍不清楚。
研究证实Notch信号在骨重建过程中发挥重要作用[5]。课题组前期研究结果显示,Notch信号通路抑制剂DAPT能抑制BMP9诱导的MSCs早晚期成骨分化;细胞接触激活Notch时,Notch信号通路5个配体[Delta-like1(DLL 1)、DLL 3、DLL 4、Jagged 1和Jagged 2] 中,DLL1表达显著升高[6]。研究报道DLL1-Notch信号通路的异常与多种疾病均存在着密切的关系[7, 8],而DLL1在BMP9诱导MSCs成骨分化过程中作用及机制研究甚少。因此,本研究拟采用重组腺病毒上调DLL1,探讨DLL1在BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用及机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞株及腺病毒永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF),骨髓间充质干细胞C3H10、C2C12,过表达DLL1腺病毒(AdDLL1),过表达红色荧光蛋白腺病毒(AdRFP),过表达BMP9腺病毒(AdBMP9),过表达绿色荧光蛋白腺病毒载体(AdGFP)均由芝加哥大学何通川惠赠,并由本实验室保存;人结肠癌细胞株HCT116由重庆医科大学分子实验室保存。
1.1.2 主要试剂DMEM高糖培养基(HyClone公司),胎牛血清(Gibco公司),小牛血清(HyClone公司),磷酸盐粉(中杉金桥公司),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂(Sigma公司),维生素C(美国Sigma),β-磷酸甘油(美国Sigma),茜素红S(美国Sigma),RT-PCR(TaKaRa公司),Real-time PCR 试剂盒(TaKaRa公司),引物(Invitrogen公司),Western及IP细胞裂解液(碧云天公司),牛血清粉BSA(Sigma公司),p-Smad1/5/8抗体(CST公司),Smad1/5/8抗体和β-actin单抗隆抗体(Santa Cruz公司),羊抗鼠、羊抗兔抗体(中杉金桥公司),Smad结合元件(Smad-binding element,SBE)荧光素酶质粒由重庆医科大学分子实验室保存,荧光素酶检测试剂(Promega公司)。实验动物选用6~8周龄的健康雄性免疫缺陷BALB/c裸鼠,体质量20~30 g,由重庆医科大学实验动物中心提供,喂养于严格消毒的无菌层流动物房内,环境温度维持在25 ℃,空气湿度为50%,饲料和水经消毒后自由进食。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养iMEF、C3H10和C2C12细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素(P/S)的DMEM培养基培养,HCT116细胞用含10%小牛血清、1%青霉素/链霉素(P/S)的DMEM培养基培养,置于37 ℃、5%CO2培养箱中,待细胞贴壁融合至50%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养。
1.2.2 条件培养基制备将HCT116细胞培养在培养皿中,待细胞生长融合至50%左右后,加入AdBMP9或AdGFP,感染率控制在50%左右,5 h后用无血清、无抗生素的DMEM培养基换液,分别于换液后24 h和48 h后各收集条件培养基1次,1 000 r/min低温离心5 min后放置于4 ℃备用。
1.2.3 Real-time PCR细胞处理3 d后,TRIzol提取总RNA,逆转录为cDNA,以GAPDH作为内参,按照Real-time PCR相关试剂盒操作说明,检测相关基因。引物由Invitrogen公司合成,引物信息见表 1。反应体系为10 μL,反应程序:预变性94 ℃ 2 min;92 ℃ 20 s; 68 ℃ 30 s;72 ℃ 20 s,延伸末尾采集荧光,40个循环;于65~99 ℃熔解曲线荧光采集。数据采用2-ΔΔCt分析。
引物 | 引物序列 | 产物长度(bp) |
DLL1 | 上游5′-CCGGCTGAAGCTACAGAAAC-3′ 下游5′-AGCCCCAATGATGCTAACAG-3′ | 121 |
ALK1 | 上游5′-ACCTGGGACTGGCTGTGA-3′ 下游5′-GCAGTCTGTGCGGATGTG-3′ | 125 |
ALK2 | 上游5′-GTGGCTCCGGTCTTCCTT-3′ 下游5′-AGCGACATTTTCGCCTTG-3′ | 125 |
GAPDH | 上游5′-GGCTGCCCAGAACATCAT-3′ 下游5′-ATGATGTTCTGGGCAGCC-3′ | 180 |
将iMEF接种于24孔板中,待细胞生长融合至30%左右,加入AdRFP或AdDLL1 6 h 后换液,待荧光出现后(约36 h),加入适当量的BMP9条件培养基,继续诱导培养7 d后进行ALP染色。ALP染色方法:弃去培养基,用去离子水清洗细胞3次,再用4%甲醛固定细胞1 min,用去离子水漂洗1次,每孔加入250 μL ALP染色液,避光放置20 min后,显微镜下观察并成像保存。
1.2.5 钙盐沉积实验将iMEF细胞接种至24孔板中,待细胞生长融合至30%左右,加入AdRFP或AdDLL1 6 h后换液,待荧光出现后(约36 h),加入适当量的BMP9条件培养基和钙盐培养基(含维生素C及β-磷酸甘油),继续培养14 d后进行茜素红S染色。茜素红S染色方法:弃去培养基,用PBS连续洗涤3次(动作要轻),每孔加入0.05%戊二醛固定细胞10 min后,弃去戊二醛并用去离子水洗涤3次,继而用0.04%茜素红S染色约30 min,待有红色堆积物时,弃去染液并用去离子水终止反应,并清洗1遍,显微镜观察并成像保存。
1.2.6 动物实验和组织化学染色将iMEF细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素(P/S)的DMEM培养基培养,置于37 ℃、5% CO2培养箱中,待细胞贴壁融30%左右时,加入AdDLL1或AdBMP9,感染率在50%左右,8 h后换液,用0.25%胰蛋白酶消化,低温离心机1 000 r/min离心3 min,去上清,用100 μL PBS重悬细胞沉淀,注射入裸鼠皮下,约2.5×106个细胞。4周后处死小鼠获取皮下包块,甲醛固定,进行microCT扫描和HE染色。
1.2.7 蛋白质提取及Western blot检测分别培养iMEF、C3H10和C2C12细胞,待细胞生长融合至30%左右时,加入AdRFP或AdDLL1 6 h后换液,待荧光出现后(约36 h),加入适当量的BMP9条件培养基,诱导培养1 h后进行蛋白质提取。蛋白质提取方法:用冰PBS洗涤细胞3次,将残余液体吸净,加入200 μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液,置于冰上裂解 5 min;用细胞刮浆细胞全部刮下,移入1.5 mL EP管中;低温离心机5 000 r/min离心20 min,小心取上清液至另1个EP管中,并加入50 μL的5×蛋白上样缓冲液,最后100 ℃沸水浴10 min,分装后置于-20 ℃保存备用。Western blot:配制浓缩胶和分离胶,100 V恒压电压下SDS-PAGE凝胶电泳,210 mA恒流电流转膜,依次加一抗和二抗孵育、洗膜,化学法发光底物进行显影。
1.2.8 SBE荧光素酶活性检测分别培养iMEF、C3H10和C2C12细胞,待细胞融合至30%左右时,用脂质体2000将SBE质粒转染入细胞内。转染过程:将3 μg的质粒与15 μL的脂质体加入至250 μL的无 血清、无抗生素培养基中,15 min后加入到含有2.5 mL 无血清、无抗生素培养基的细胞中,转染6 h后换液。放置细胞于培养箱37 ℃,5% CO2培养过夜后,将转染后的细胞接种于24孔板,待细胞贴壁后加入AdDLL1或AdBMP9,感染率在50%左右,8 h后换液,继续培养36 h后裂解细胞,1 000 r/min离心15 min,取上清50 μL 与20 μL底物反应,检测SBE荧光素酶活性。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0进行统计学分析,数据以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 AdDLL1上调iMEF细胞中DLL1的mRNA表达用AdDLL1或AdRFP感染iMEF细胞36 h后,荧光显微镜观察结果显示,病毒感染效率为30%左右(图 1);培养3 d后,qRT-PCR检测DLL1的mRNA表达变化,结果显示:iMEF细胞内源性DLL1表达量很少;AdDLL1处理组与对照组相比,DLL1表达量显著增加(P<0.05)。
2.2 DLL1促进BMP9诱导的iMEF细胞早晚期成骨分化采用AdDLL1/AdRFP感染iMEF细胞,BMP9条件培养基诱导成骨分化,分别在第7天和第14天采用ALP染色和茜素红S染色检测成骨早期指标ALP及成骨晚期指标钙盐沉积。结果显示,单独DLL1对ALP活性及钙盐沉积没有影响,但能显著上调BMP9诱导iMEF细胞的ALP活性和钙盐的沉积(图 2)。这表明DLL1能够促进BMP9诱导的iMEF细胞早晚期成骨分化。
2.3 DLL1促进BMP9诱导的iMEF细胞在裸鼠皮下异位成骨分别用AdDLL1或AdBMP9处理iMEF细胞后,1 d后收集细胞注射入裸鼠皮下,4周后皮下包块形成,剥离皮下包块。肉眼观察包块体积,发现与BMP9组比较,BMP9+DLL1组异位成骨包块体积明显增大(图 3);包块切片HE染色结果显示,BMP9+DLL1组骨小梁数目增多(图 4);用microCT检测骨体积和骨密度,结果显示BMP9+DLL1组的骨体积及骨密度明显高于BMP9组(图 5)。体内实验表明,DLL1明显增强BMP9诱导的iMEF细胞在裸鼠皮下异位成骨。
2.4 DLL1对BMP9信号通路Ⅰ型受体的影响在明确DLL1在体内外皆有促进MSCs成骨作用后,为了进一步探讨DLL1促进BMP9诱导的MSCs成骨分化的机制,首先采用qRT-PCR检测DLL1对BMP9信号通路Ⅰ型受体ALK1、ALK2 mRNA表达水平的影响。结果显示,单独的DLL1对iMEF细胞中ALK1和ALK2 mRNA的表达没有影响;在BMP9存在的情况下,DLL1能明显促进ALK2 mRNA的表达,但对ALK1的mRNA表达没有影响(P<0.05,图 6)。
2.5 DLL1增加BMP9经典信号通路中Smad1/5/8的磷酸化水平为了探究DLL1对BMP信号通路中Smad1/5/8的影响,采用Western blot检测AdDLL1等处理后的iMEF、C3H10和C2C12细胞中的Smad1/5/8及磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,BMP9+DLL1组能明显上调p-Smad1/5/8的水平,但对Samd1/5/8蛋白量没有影响(图 7)。
2.6 DLL1对BMP9经典信号通路转录活性的影响采用荧光素酶实验检测AdDLL1等处理后iMEF、C3H10和C2C12细胞核内SBE的转录活性。结果显示,与对照组相比,BMP9+DLL1组能够增加BMP9诱导的SBE荧光素酶活性(P<0.05,图 8)。这提示激活DLL1信号通路后可促进BMP9信号通路的核内转录水平。
3 讨论MSCs存在于骨髓、脐带血等组织中,具有多向分化潜能[9],在相应的诱导条件下可向不同组织如成骨、成脂等方向分化。BMPs是MSCs成骨分化中重要的诱导因子[10, 11, 12]。BMPs-Smad经典信号通路主要为BMPs与其受体结合,使Smad1/5/8磷酸化,p-Smad1/5/8与Smad 4结合形成复合物转移至细胞核内,与下游靶基因启动子元件结合,调控下游靶基因的转录[13]。
Notch信号广泛存在于多种脊椎与非脊椎动物体内,具有高度的保守性,是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一,其与多种肿瘤的发生、发展密切相关[14]。哺乳动物有4种Notch受体(Notch1~4)和5种Notch配体(Jagged 1、Jagged 2、 DLL 1、DLL 3和 DLL 4),均属于单次跨膜蛋白,相邻细胞间通过配受体结合从而激活
下游靶基因[15]。近年来,Notch在骨发育及重建中的作用受到重视[16],研究者对Notch与BMPs、Wnt等信号通路相互协调,调控MSCs成肌、成脂、成软骨和成骨分化等方面进行了研究,但其机制尚不清楚。本课题组采用DAPT、dnNotch1抑制Notch信 号通路后,BMP9诱导的MSCs成骨作用减弱,与Tezuka 等[17]提出的观点相符合。DLL1作为Notch信号通路中5个配体之一,含有1个短C端胞内片段、8个表皮生长因子样拷贝和1个Delta/Serrat/Lagged (DSL)结构域。我们前期研究发现,在MSCs成骨分化过程中,高细胞密度激活Notch后,配体中DLL1明显升高[6]。因此本研究采用重组腺病毒上调DLL1研究其在BMP9诱导的MSCs成骨分化中的作用及机制。
在验证AdDLL1能增加MSCs细胞内DLL1 mRNA表达的基础上,我们初步证实DLL1能促进BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用,同时裸鼠皮下异位成骨实验进一步证实DLL1在体内具备同样的作用;不仅与我们前期研究结果一致[18],也与Nobta等[10]发现DLL1促进BMP2诱导的成骨分化的研究相呼应。 同时,我们进一步探讨了DLL1对BMP9信号通路的影响,结果发现DLL1能促进 BMP Ⅰ型 受体ALK2的表达,亦能上调Smad1/5/8磷酸化水平及SBE的转录活性。
综上所述,本研究证实Notch信号通路的配体DLL1在体内外都具有促进BMP9诱导MSCs成骨分化的作用,且该效应可能通过影响BMP9信号通路的多个环节来实现。
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