脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)是DNA碱基切除修复(base excision repair,BER)的核心修复酶，其活性直接决定了细胞BER的整体功能。现有的研究显示，APE1是一个多功能蛋白，主要功能有C端的脱嘌呤脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)核酸内切酶和N端的氧化还原功能[1]。APE1在肿瘤组织的高表达与肺癌、肝癌、卵巢癌及骨肉瘤患者预后差呈正相关，提示其在肿瘤发生、发展中具有重要作用。进一步功能研究提示，APE1与肿瘤细胞耐药、血管形成、放疗耐受等重要的肿瘤生物学特征也密切相关，以APE1为抗癌靶点具有潜在研究价值[2, 3, 4]。AP核酸内切酶活性是APE1核心功能，也是哺乳动物细胞生存所必需的生物学活性。在肿瘤学研究中，AP核酸内切酶活性的测定对于分析肿瘤细胞DNA修复能力强弱，发现APE1抑制剂等都十分重要，是DNA修复研究的重要研究方法。目前AP核酸内切酶活性的检测主要依赖与同位素标记的探针底物，在推广应用上受到了很大的限制。因此，本研究拟建立一种基于远红外荧光的AP核酸内切酶检测方法。
1 材料与方法 1.1 主要材料γ-32P-ATP 250 μCi (Perkin Elmer公司，美国)，含有AP位点的DNA探针，序列如下：5′-GTGGATCCGT-ACTCTG F GTACGTGTCAACACGAATTCGA-3′(F代表AP位点)，其互补链序列为：5′-TCGAATTCGTGTTGACACGTACCCAGAGTACGGATCCAC-3′，由TaKaRa公 司(大连)合成，含AP位点的探针5′端由IR700标记 (美国IDT公司专利)，由IDT公司(美国)合成。T4 PNK 试剂盒(NEB公司，美国)，UreaGel变性丙烯酰胺凝胶制胶试剂盒(National Diagnostics公司，美国)，10×TBE(Life Technologies公司，美国)，过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)(Sigma Aldrich公司，美国)。
1.2 自制APE1纯化蛋白含有APE1全场表达序列的pET11a-hAPE1载体由美国NIH老化研究所David Wilson Ⅲ教授馈赠。该载体可表达无任何外源性多肽标签的野生型人APE1蛋白，与内源性APE1蛋白一致。将pET11a-hAPE1质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，得到单克隆扩增并作为种子菌液接种至1 L LB培养基中，37 ℃振摇3～4 h至培养液光密度值为0.6，加入0.5 mmol/L IPTG继续在20 ℃振摇过夜。收集细菌，用30 mL Buffer A[50 mmol/L两性离子缓冲剂-氢氧化钾(HEPES-KOH),pH=7.5,5%甘油(glycerol),50 mmol/L KCl]重悬细菌沉淀。用超声法破碎细菌释放蛋白，而后以20 000×g离心去除碎片及未破碎细菌，上清用于离子交换法纯化。首先将上清上柱至Q20阴离子交换柱，监测UV吸收值直至恒定不变。收集穿透液并上柱至S10阳离子交换柱，监测UV吸收值直至恒定不变，而后用Buffer B(50 mmol/L HEPES-KOH,pH=7.5,5% glycerol,700 mmol/L KCl)与Buffer A梯度混合液洗脱结合在S10阳离子交换柱上的蛋白(>95%为APE1蛋白)，用4 mL组分分离收集管收集各个组分，并提取峰值对应的洗脱组分进行进一步浓度、纯度及活性的检测。
1.3 远红外荧光探针制备反应体积20 μL，IR700标记的、含AP位点的DNA探针(10 pmol/μL) 2 μL ,10×PNK Buffer 2 μL，互补探针(10 pmol/μL) 4 μL，超纯水12 μL，放入 PCR仪，95 ℃ 5 min，由95 ℃降到25 ℃，每循环(1 min)降1 ℃，共70个循环。制备好后置于4 ℃避光保存备用，可保存1个月。
1.4 同位素标记探针反应体积20 μL，含AP位点的DNA探针(10 pmol/μL) 2 μL ,超纯水5 μL，10×PNK Buffer 1 μL，γ-32P-ATP(10 μCi/μL 1 uL，T4 PNK 1 μL，混匀后瞬时离心后放于PCR仪，37 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min，4 ℃ 6 min，反应完成后加入2倍量互补探针(10 pmol/μL) 4 μL，超纯水6 μL，再次放入PCR仪，95 ℃ 5 min，由95 ℃ 降到25 ℃，每循环(1 min)降1 ℃，共70个循环。
1.5 同位素探针法检测AP内切酶活性反应体积10 μL，含不同量(10～1 000 pg)的APE1纯化蛋白，1 pmol γ-32P-ATP标记的底物和AP反应缓冲液(10 mmol/L HEPES-NaOH，pH=7.5,100 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2)；37 ℃孵育10 min，加入10 μL 2×Stop Buffer甲酰胺终止反应后于95 ℃变性5 min，含有8 mol/L尿素的15%变性聚丙烯酰胺凝胶预电泳30 min,冲孔，上样，电泳300 V 70 min后，于暗室中X光胶片-70 ℃压片过夜，第2天显影、定影。
1.6 荧光探针法检测AP内切酶活性反应体积10 μL，含不同量(10～1 000 pg)的APE1纯化蛋白，1 pmol荧光标记的底物和AP反应缓冲液(10 mmol/L HEPES-NaOH，pH=7.5,100 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2)；37 ℃孵育10 min，加入10 μL 2×Stop Buffer甲酰胺终止反应95 ℃ 5 min，含有8 mol/L 尿素的15%变性聚丙烯酰胺凝胶先冲孔预电 泳30 min，取10 μL反应产物，上样电泳300 V 70 min，切下凝胶荧光扫描(LI-COR ODYSSEY红外线双色扫描激光成像系统)。
2 结果 2.1 同位素法检测AP核酸内切酶活性用同位素法检测AP内切酶活性，不同量APE1蛋白可以将不同比例的底物转化为产物，10 pg APE1蛋白转化的底物在同位素法的结果中无法显示，100 pg大致能转化10%的产物，而1 000 pg则可将全部1 pmol 的底物转化为产物。从图 1中可以看出，同位素法得到的图像清晰，无杂带，便于计算转化率和酶活性。但由于同位素显影过程需放置于-70 ℃过夜成像，因此整个操作过程大约需要1 d，而且受到同位素半衰期的影响，实验安排受到极大限制。
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| 图 1 同位素法检测AP内切酶活性 |
用远红外荧光法检测AP内切酶活性，不同量APE1蛋白可以将不同比例的底物转化为产物，在同位素法的结果中无法显示的10 pg APE1蛋白转化的底物在远红外荧光法中可清晰显示，100 pg大致能转化30%的产物，而1 000 pg则可将接近95%的1 pmol的底物转化为产物，但仍有少部分无法转换为产物，更加符合酶促反应的规律。从图 2中可以看出，远红外法由于探针为商业化合成，灵敏度较高，因此底物出现了双条带，分子量较大的为未变性的底物，为双链DNA，在PAGE胶中泳动速度较慢。整个操作过程大约需要2 h，而且实验安排非常灵活，不受场地、底物批号的影响。
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| 图 2 远红外法检测AP内切酶活性 |
AP核酸内切酶活性是APE1核心功能，也是哺乳动物细胞生存所必需的生物学活性。Xanthoudakis等[5]的研究显示，AP核酸内切酶活性位点E96、Y177等突变的小鼠均无法存活，亦凸显了AP核酸内切酶的活性。在人类细胞中，APE1承担了>95%的AP核酸内切酶活性，仅有少数的候选酶具有替代的微弱的活性，在Li等[6]的研究中也提示用纯化蛋白和细胞核提取物进行AP核酸内切酶检测具有同等的趋势，再次确证了APE1在细胞内的重要性。
AP核酸内切酶活性的检测是一个在APE1研究中非常重要的手段，目前基本的方法主要包括同位素标记法和分子信标法。同位素标记法是在一段含有AP位点的寡核苷酸的5′端用γ-32P-ATP标记，而后将该底物与纯化APE1蛋白或细胞核提取物进行反应，将反应物用变性PAGE胶分离后进行同位素显影，通过比对具有不同分子质量的产物和底物的量来测定AP内切酶活性的方法。而分子信标法则利用5′端荧光标记的AP位点探针(AP位点距5′端<5 nt)与3′含有荧光淬灭基团进行退火得到无荧光信号的底物，当AP位点被加入的APE1蛋白切开后，则释放荧光标记的产物，从而测定AP核酸内切酶的活性[7]。两种方法各有优缺点，同位素法较灵敏，可靠性高，可重复性好，但操作繁琐，对身体和环境均有不利影响；分子信标法无辐射污染，定量方便、快速，但重复性较差，灵敏度不如同位素法。本研究正是结合两种方法创立了一种基于远红外标记的AP核酸内切酶活性的检测方法，该方法具有很好的可重复性，较同位素法具有灵敏度更高、无放射污染、操作快速等特点，适合普通实验室推广。
| [1] | Li M, Wilson D M 3rd. Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(4): 678-707. |
| [2] | Wang D, Luo M, Kelley M R. Human apurinic endonuclease 1 (APE1) expression and prognostic significance in osteosarcoma: enhanced sensitivity of osteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibition. Mol Cancer Ther, 2004, 3(6): 679-686. |
| [3] | Wang D, Zhong Z Y, Li M X, et al. Vector-based Ape1 small interfering RNA enhances the sensitivity of human osteosarcoma cells to endostatin in vivo. Cancer Sci, 2007, 98(12): 1993-2001. |
| [4] | Wang D, Xiang D B, Yang X Q, et al. APE1 overexpression is associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and targeted inhibition of APE1 enhances the activity of cisplatin in A549 cells. Lung Cancer, 2009, 66(3): 298-304. |
| [5] | Xanthoudakis S, Smeyne R J, Wallace J D, et al. The redox/DNA repair protein, Ref-1, is essential for early embryonic development in mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(17): 8919-8923. |
| [6] | Li M, Völker J, Breslauer K J, et al. APE1 incision activity at abasic sites in tandem repeat sequences. J Mol Biol, 2014, 426(11): 2183-2198. |
| [7] | Simeonov A, Kulkarni A, Dorjsuren D, et al. Identification and characterization of inhibitors of human apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1. PLoS One, 2009, 4(6): e5740. |