已有研究发现严重弱精症或精子完全无运动的患者存在精子纤维鞘发育不良[1],精子形成过程中睾丸特异性基因的适时有序表达,并驱动精子各细胞器的有序形成包括精子鞭毛骨架结构和相关蛋白的有序装配整合是保证精子发挥正常功能的根本物质基础[2]。纤维鞘CABYR结合蛋白(fibrous sheath CABYR-binding protein,FSCB)是在精子形成过程中特异性表达并最终定位于精子鞭毛纤维鞘上的一种新蛋白,由李彦锋教授[3]在美国率先发现和鉴定。前期的研究发现FSCB、CABYR等蛋白可能通过直接或间接的相互作用结合装配于纤维鞘的支架蛋白AKAPs上,形成巨分子蛋白复合物,共同发挥纤维鞘的生理功能。根据其基本特性,推断该蛋白可能是一种参与精子鞭毛运动,与精子获能和超活化作用有关的重要蛋白[3]。本研究应用CRISPR/Cas9系统靶向敲除小鼠fscb基因并建立动物模型,为深入探讨FSCB蛋白缺失后精子发生,精子形成和精子形态结构的可能改变以及该蛋白在精子中的生物学功能提供了保证。
1 材料与方法 1.1 主要材料大肠杆菌、LB琼脂平板、B6J小鼠、PUC57-T7-GDNA表达载体、Cas9表达载体(均由南京大学模式动物研究所提供)、T7 Ultra 试剂盒/MEGAshortscript试剂盒(Ambion,AM1345)、PCR纯化试剂盒(南京大学模式动物研究所),DH5α感受态(Transgene公司),限制性内切酶BsaⅠ、DraⅠ、AgeⅠ、T4 Ligase/T4 Buffer连接酶、Taq酶和dNTP等(NEB公司),质粒小量提试剂盒(天根生化科技有限公司),琼脂糖胶回收试剂盒(康为世纪公司),抗-FSCB 抗体(李彦锋教授国外研究制备),山羊抗豚鼠IgG(博奥生物有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 sgRNA设计和寡聚核苷酸链的合成鼠Fscb基因定位于第12条染色体的12C1区段(Chromosome 12: 65,572,320-65,575,885,ENSMUST 00000059833),全长3 566 bp,仅有单一的外显子,无内含子,表达蛋白全长1 062 aa。针对该基因,通过在线免费设计sgRNA的软件(http://crispr.mit.edu/),设计3对针对fscb基因的向导RNA寡聚核苷酸链:正义链1:TAGGATGAAGAGAAAGCATGTCC,反义链1:5′-AAACGGACATGCTTTCTCTTCATC-3′;正义链2:5′-TAGGTGAGTTAGAAATTATTATC-3′,反义链2:5′-AA-ACGATAATAATTTCTAACTCAC-3′;正义链3:5′-TAG-GGAATACTCTGTGGCAATTC-3′,反义链3:5′-AAACGAATTGCCACAGAGTATTCC-3′。将fscb sgRNA寡核苷酸单链以逐步降温的方法退火成双链,程序如下:95℃,5min;94℃,1min,-1℃/循环,22个循环;72℃,30min;71℃,1min,-1℃/循环,46个循环;4℃ 保持备用。
1.2.2 sgRNA表达载体构建将3对sgRNA寡核苷酸双链稀释至0.5μmol/L。用BsaⅠ酶切pUC57-T7-GDNA质粒使其线性化,回收后稀释至50mg/L,然后与3对寡核苷酸双链分别进行连接,连接体系:线性化的pUC57-T7-GDNA质粒2μL,sgRNA寡核苷酸双链6μL,T4连接酶1μL,T4 缓冲液1μL,16℃连接6h或过夜。连接后转化感受态大肠杆菌,涂布于含125μg/mL卡那霉素的LB琼脂平皿上进行培养。次日在LB琼脂平板上挑取具有卡那霉素抗性的单克隆菌落,溶于20μL LB液中,涡旋后,将部分菌液接种到LB液中,37℃,半径=50mm,250r/min下振摇培养,另一部分的菌液提取质粒DNA,进行测序鉴定。鉴定正确的阳性克隆保存备用。
1.2.3 sgRNA和Cas9表达载体的体外转录sgRNA的表达载体pUC57-T7-GDNA-sgRNA经DraⅠ酶切线性化,Cas9表达载体经AgeⅠ酶切线性化,两者均经酚氯仿抽提纯化后,溶于无核酸酶的水中作为模板,用于体外转录。sgRNA的体外合成利用MEGA shortscript试剂盒(Ambion,AM1354)在体外通过T7 RNA聚合酶完成。Cas9 mRNA 的合成利用T7 Ultra试剂盒 (Ambion,AM1345)在体外通过T7 RNA聚合酶完成。上述载体转录合成均在南京大学模式动物研究所完成。
1.2.4 Cas9/sgRNA的原核注射获得F0代初建鼠转录好的sgRNA和Cas9 mRNA 混合并调整浓度至每种sgRNA 10 ng/μL和20 ng/μL,显微注射法将RNA混合物注射到B6J鼠受精卵的雄核和细胞质中,用 B6J小鼠作为假孕受体鼠,移植成功后获得基因敲除的初建鼠。实验中小鼠编号为“数字”加“#”上标表示,如“1#”,以此逐一编号。实验中涉及动物操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用与管理委员会批准。
1.2.5 fscb基因敲除鼠基因鉴定及测序F0代初建鼠在出生7~14d时,剪取鼠尾组织提取基因组DNA。设计1对包含sgRNA作用靶点的鉴定引物,正向引物:5′-GCTTCAGTACAACCTCCTGCC-3′,反向引物:5′-CAACCAAAGGATCTTCTTGTGC-3′。PCR反应体系50 μL。反应条件:95℃ 5min;(95℃ 30s,58℃ 30s,72℃40 s)×40;72℃ 5min;保存于16℃。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离,通过PCR产物大小进行判断可能的阳性鼠。野生型小鼠其扩增片段大小为520bp,如果CRISPR/Cas9对靶基因相应位点造成了突变,该520bp的PCR产物将消失,代之以缩小的片段。表明靶点DNA系列可能存在突变,通过TA克隆、测序检查确定突变。
1.2.6 Western blot证实FSCB蛋白在睾丸和精子内的表达缺失取后续繁育A line 和D line雄鼠野生、杂合、纯合各1只精液及睾丸组织用RIPA-NP40蛋白裂解液提取蛋白作Western blot。一抗稀释:称抗-FSCB抗体粉剂1/10,溶解于100μL预冷的双蒸水中,充分溶解后分装,-20℃保存。稀释后的抗体使用前1∶1 000稀释于含5% BSA,0.1% NaN3的TBST中。Marker: Fermentas 26616(SM-0671);二抗,山羊抗豚鼠IgG 1∶10 000稀释。
本实验应用CRISPR/Cas9系统实现小鼠fscb基因靶向敲除并建立动物模型,其过程及步骤(图 1)。
2 结果 2.1 表达载体的构建pUC57-T7-GDNA质粒经BsaⅠ酶切使其线性化,经设计的3条sgRNA寡核苷酸双链形成的黏性末端与BsaⅠ酶切的黏性末端相匹配。3条sgRNA寡核苷酸双链分别与上述载体连接,成功构建3种PU57-T7-GDNA-sgRNA载体。经测序验证序列正确无误。
2.2 获得CRISPR/Cas9介导敲除fscb基因小鼠sgRNA的表达载体pUC57-T7-GDNA-sgRNA和Cas9表达载体经体外转录后,将转录好的sgRNA和Cas9 mRNA混合物通过显微注射法注射到B6J鼠受精卵内,并将受精卵移植进 B6J假孕鼠。第1次将124枚移植进6只假孕鼠,妊娠3只小鼠并生产3只,剪鼠尾提取DNA作为PCR模板,经过鉴定后未获得阳性小鼠。第2次注射,增加注射和移植数量,将360枚受精卵移植进13只假孕鼠,有11只妊娠,并产生71只小鼠,有2只意外死亡,总共获得了69只小鼠,经过PCR鉴定后获得39只阳性小鼠(图 2),为F0代小鼠。根据与野生型小鼠PCR结果的比较分析,将PCR产物大小发生明显变化,条带单一,无杂带的23#\29#\33#\46#\59#\64#共6只鼠的 PCR产物进行连T载体并测序分析,鉴定改造后基因序列。PCR产物连T测序结果显示:产生5中不同的基因型,33#命名为A Line(图 3A);23#命名为B Line;29#命名为C Line;59#和64#为同一种基因型(图 3B),命名为D Line;46#存在基因改变,但没有实现移码。其余5只小鼠在删除基因片段后都产生移码。最终选择A line 和D Line的33#、59#和64#用于回交野生鼠繁育。将33#、59#和64#雄鼠与B6J雌鼠交配获得小鼠为F1代,33#后代中获得1雄2雌3只阳性小鼠;59#后代中获得1雄1雌2只阳性小鼠。再次行PCR鉴定(图 4)及测序(图 5)。结果:F0代33#和其子代91#、95#、96#均在481~614bp的区域发生了134bp的删除,同时在第2个靶点有8bp的删除。F0代59#和其子代72#、74#均在第1个靶点有9个碱基发生了删除,在605~783bp的区域发生了179bp的删除。表明:F1代小鼠测序结果与F0代基因型相同,显示Cas9/sgRNA介导的基因突变可以稳定传代。我们将F1代获得的杂合子雄鼠与雌鼠交配,获得纯合子小鼠。为此,我们建立了2种不同基因型的fscb基因敲除鼠系,并传代繁育。
2.3 基因敲除后小鼠精液和睾丸FSCB蛋白表达的Western blot分析
取A line和D line野生型、杂合子、纯合子雄鼠各1只,获取精液及睾丸组织,应用RIPA-NP40蛋白裂解液提取蛋白后,进行Western blot分析。结果显示,野生型小鼠精液及睾丸蛋白提取物中FSCB蛋白位于约270bp大小平面,而A Line 和D Line 的纯合子雄鼠的精液(3、6泳道)和睾丸(9、12泳道)中FSCB蛋白表达消失,杂合子小鼠FSCB蛋白在精液(2、5泳道)和睾丸(8、11泳道)中的表达与野生型相比略降低(图 6)。
3 讨论基因敲除是研究基因功能最直接有效的方法之一。早期的传统基因敲除主要是应用同源重组原理通过设计的同源片段替代靶基因片段,从而使目的基因的功能丧失[4],但同源重组方法总体而言存在效率低,技术要求高,时间周期长而且成本高的缺点,严重制约了相关基础研究的发展。本研究前期曾应用传统的同源重组技术试图进行fscb基因敲除,经反复尝试未能成功。近年来,新的基因靶向敲除技术不断涌现,为该领域的研究提供了更为高效快捷的平台,如锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)技术[5, 6]、转录激活子样效应因子核酸酶[transcription activator-like(TAL) effector nucleases,TALENs]技术[6, 7, 8, 9]和最新出现的规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)/(CRISPR-associated,Cas)系统[10, 11, 12, 13]。尤其是CRISPR/Cas9 技术不再需要传统技术所必需的胚胎干细胞,其操作更加简便快捷,应用范围更广,靶向效率更高,而且可以在同一细胞中同时进行多个靶点的操作[14]。显然比之传统基因敲除技术具有更加显著的优势。
CRISPRs/Cas系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫防御机制,可通过序列特异的RNA介导,对入侵的外源性遗传物质进行靶向定位并利用Cas酶进行酶切、降解[15]。该系统分为3种类型,其中类型Ⅱ由于组成简单,只需要存在核酸酶Cas9蛋白、CRISPR-derived RNA (crRNA) 、Trans-activating crRNA(tracrRNA)、RNaseⅢ 4种成分即可发挥作用[16],因而被改造成基因组靶向编辑工具。经过改造的Ⅱ型CRISPRs/Cas9系统能够利用RNA介导的DNA靶向功能对多种生物基因组的任意区域进行编辑[17, 18, 19, 20]。CRISPR能够转录产生前体crRNA(Pre-CRISPR RNA,Pre-crRNA),Pre-crRNA经过Cas9-tracrRNA复合物加工后生成成熟的crRNA,crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对,而3′端能够与tracrRNA及Cas9形成复合物,从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性切割[16]。这一系统仅仅需要根据目的基因序列,设计一种向导RNA (sgRNA),在其介导下即可实现定向基因打靶[21],因此自从该技术出现后即获得广泛认可和青睐。
由于本研究前期应用同源重组技术未能成功敲除fscb基因,故改用CRISPR/Cas9系统,结果顺利构建sgRNA表达载体并成功获得阳性克隆小鼠,从而建立了A Line 和D Line两种fscb基因敲除鼠系。在本研究中,我们将sgRNA和Cas9 RNA混合物注入124枚受精卵,移植进6只假孕鼠,结果仅有3只小鼠妊娠,最终仅生产3只小鼠,经过鉴定后未获得阳性小鼠。所以第2次注射增加了sgRNA和Cas9 RNA混合物注射量和受精卵的移植数,注射360枚受精卵,移植进13只假孕鼠,共有11只妊娠,并产生69只存活小鼠,通过PCR鉴定后获得39只阳性小鼠,突变率为56.5%。
在建系中,因每1只F0代小鼠的基因删除情况都不一样,故每个F0代小鼠称为一个line。F0代首建鼠可能出现多种删除的情况,故原则上F0代小鼠之间不能相互交配。为了确保产生的移码突变能整合进生殖系并稳定传代,我们将其与同背景的野生型小鼠进行交配;选择其中产生移码突变的后代进行进一步的繁育。本研究获得的F0代和F1代小鼠均首先通过PCR方法对基因片段的删除情况进行鉴定,然后通过将PCR产物连接T载体,再进行测序确认基因删除的具体片段和是否产生移码突变。对确认产生移码突变的来自于同一个line的F1代杂合子再通过其互配获得fscb基因敲除的纯合子小鼠。为了验证我们所建鼠系,对纯合子子代亦进行了PCR鉴定和测序,对比基因型与母代相同,得到稳定传代的基因突变小鼠。成年后小鼠的FSCB蛋白表达情况,经反复Western blot证实,其在纯合子雄鼠睾丸和精子内的蛋白表达消失。
本研究前期对鼠FSCB蛋白的基本生物学特性研究发现,该蛋白与精子纤维鞘蛋白AKAP3、AKAP4[22]、CABYR 等具有极为相似的定位特征,同时具有钙结合能力,并且其丝氨酸/苏氨酸在体内外均可被蛋白激酶A(PKA)磷酸化。既往基因敲除小鼠的研究证实:Akap4-/-纯合子雄鼠产生的精子数量正常,但存在纤维鞘形成缺陷,表现为缩短的柱状体和稀薄的环状肋板,同时精子丧失前向运动而表现为不育,其机理分析认为是由于缺乏AKAP4情况下信号转导的失败所致[22]。基于前期研究对FSCB蛋白相关生物学特性的认识,为了解其在精子的形成和运动过程中的具体作用,本研究应用CRISPR/Cas9基因敲除方法建立了fscb基因敲除小鼠动物模型,为探讨FSCB蛋白缺失后精子发生、形成、形态结构改变以及该蛋白在精子中的生物学功能的改变奠定了基础。
由于精子形成过程的特异性基因在鼠和人之间绝大部分具有高度保守性,fscb基因在鼠和人之间也具有很强的保守性,因而从基因敲除小鼠所获得的重要生物学信息很可能适合应用于人类不育的病因学诊断和治疗。CRISPR/Cas9系统具有操作简单、靶向精确性高、基因修饰高并可稳定遗传,可实现靶基因多点同时敲除而且无物种限制,实验周期短等特点[23]。为此,本研究应用CRISPR/Cas9系统技术,获得fscb基因敲除小鼠,不但为下一步鉴定fscb基因敲除小鼠的表型特征尤其是fscb基因缺失对生育能力的影响提供了动物模型,而且为进一步进行精子特异性表达基因的多位点敲除研究提供了技术支撑。
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