2.400014 重庆，重庆市急救医疗中心神经外科；
3.400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所病理科
2.Department of Neurosurgery, Chongqing Emergency Medical Center, Chongqing, 400014;
3.Department of Pathology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
创伤性脑损伤 (traumatic brain injury,TBI)也称脑外伤，是由创伤引起的脑组织损伤，存在较高的病死率和病残率[1] 。TBI后急性期的病理学事件如炎症、氧化应激、凋亡等都能促成神经元死亡和神经功能障碍[1]。McTigue等[2] 、Park等[3] 及Sauerbeck等[4]发现过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)激动剂吡咯列酮能减少创伤性脑损伤后脑皮层挫伤面积，有助于神经功能恢复。文献[5]指出大剂量的吡格列酮能够抑制大鼠脑损伤皮层小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，保护神经元，使TBI大鼠记忆认知功能提高。另有一些研究表明PPAR 配体可以通过PPARγ 非依赖途径发挥其生物学作用[6-9]。Thal等[10]发现尽管罗格列酮与PPARγ的亲和力远大于吡格列酮与PPARγ亲和力，吡咯列酮能减轻TBI后组织学损伤，但罗格列酮却无此作用，提示吡咯列酮可能不是通过激活PPARγ途径来发挥神经保护作用。Thal等[10]还发现低剂量的吡格列酮仍然能在TBI后发挥神经保护作用，说明吡格列酮的神经保护作用可能不依赖PPARγ 。本实验拟通过对大鼠用不同剂量吡格列酮治疗TBI和T0070907干预PPARγ受体，比较不同处理方式下TBI大鼠脑组织HE、Nissl、TUNEL染色后的形态学差异和PPARγ mRNA表达量的差异，探讨低剂量吡格列酮是否可以通过非 PPARγ依赖途径对创伤性脑损伤发挥神经保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验药品与试剂盐酸吡格列酮(日本武田)；T0070907(Sigma中国)；尼氏染料、TUNEL试剂盒(罗氏)；RNA试剂盒、逆转录试剂盒、荧光染料SYBR(TaKaRa公司)；PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2 实验动物分组与干预健康雄性SD大鼠30只，体质量200 g左右，鼠龄6周，购于重庆医科大学实验动物中心。将大鼠分为 6组，假手术组(生理盐水1.0 mL/kg)、Pio 1.0组(吡格列酮1.0 mg/kg)、Pio 10.0组(吡格列酮10.0 mg/kg)、 T0070907 组(T0070907 1.0 mg/kg)、T+Pio 1.0组(T0070907 1.0 mg/kg+吡格列酮1.0 mg/kg)及TBI组(生理盐水 1.0 mL/kg)，每组5只。用药剂量利用黄继汉等[11]编制的动物与人体间等效剂量换算公式Db=Da×Rab×Sb (Db为150 g大鼠用药剂量，Da 为60 kg成人用药剂量，Rab为换算系数6.17，Sb为体质 量校正系数0.916)进行换算，计算出200 g的SD大鼠摄入吡格列酮标准剂量为2.8 mg/kg，因此本实验主要用大剂量10.0 mg/kg (Pio 10.0) 和低剂量1.0 mg/kg (Pio 1.0) 对实验大鼠的进行治疗，并比较其治疗效果。吡格列酮和T0070907 分别溶于二甲基亚砜 (DMSO)后用生理盐水稀释[10, 12],终浓度为 1 g/L。给药方式为腹腔注射，给药时间为术前30 min、 术后8 h/次，3次/d。
1.3 TBI模型制备实验采用改良的Feeney自由落体硬膜外撞击方法建立创伤性脑损伤模型，SD大鼠麻醉后俯卧位将头固定于脑立体定位仪上，去毛消毒后切开头皮，暴露顶骨，在前囟点和人字点右侧3 mm处做直径5 mm的骨窗，硬脑膜保持完整；将重物锤(约25 g)从40 cm高度处自由落下打击硬脑膜，骨蜡封闭骨窗、缝合头皮、消毒后置于28 ℃房间内，充分供应鼠粮和水。假致伤组仅打开颅骨，暴露硬脑膜，不作自由落体重物锤打击。
1.4 病理切片制作与染色4%多聚甲醛心脏灌注后取6组SD大鼠模型脑组织，大小约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm,4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后进行切片，切片厚度约为5 μm，石蜡脱烤，常规HE染色、Nissl染色、TUNEL染色分别观察病变区及附近细胞形态变化、尼氏体脱失情况、神经细胞凋亡情况；每张切片在光学显微镜下(×200)，在致伤脑皮层周围取不重叠的5个视野观察后并拍照；计算相应切片尼氏体脱失率(尼氏体脱失率=脱失尼氏体/尼氏体总数×100%)、凋亡细胞数。
1.5 PPARγ mRNA相对表达水平的检测 1.5.1 提取RNA及逆转录大鼠建模24 h后予以麻醉、冰上直接断头快速取出脑组织；分别取适量大鼠脑皮层组织加入TRK裂解液充分裂解，匀浆器充分匀浆、提取RNA、测浓度、反转录制备cDNA后行荧光定量PCR。引物序列见表 1。
| 引物名称 | 引物序列 | 长度(bp) |
| PPARγ 上游序列 | 5＇-CCTCCCTGATGAATAAAGATGG-3＇ | 22 |
| PPARγ 下游序列 | 5＇-CACAGCAAACTCAAACTTAGGC-3＇ | 22 |
| β-actin上游序列 | 5＇-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3＇ | 20 |
| β-actin 下游序列 | 5＇-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3＇ | 20 |
以上述逆转录cDNA为RT-PCR 扩增模板，PCR反应体系为10 μL，PCR反应条件如下:95 ℃预变性2 min，(95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s)共40个循环，72 ℃延伸10 min，每组设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达。 1.6 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件，各组数据以 表示，对所有数据进行单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 低剂量吡格列酮能减轻TBI后细胞损伤光镜观察结果显示：假致伤组大鼠脑组织细胞核被染为均匀的蓝黑色，胞质、胞核结构清晰，细胞结构完整，细胞核浓缩及炎性细胞浸润较少(图 1A)；T0070907组和TBI组在损伤侧脑皮层周围可见大小不等的组织挫裂，结构紊乱，广泛细胞核浓缩及炎性细胞浸润，而Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、Pio 10.0组细胞核染色质浓缩和炎性细胞浸润较T0070907组和TBI组轻(图 1)；Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、Pio 10.0组细胞损伤率均低于T0070907组和TBI组，差异有统计学意 义 (P<0.05，表 2)，Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、Pio 10.0组 3组组间无统计学差异(P>0.05，表 2)，T0070907组和TBI组2组之间无统计学差异(P>0.05，表 2)；表明低剂量吡格列酮均能减轻创伤性脑损伤后的神经细胞损伤，而T0070907不能影响吡格列酮的神经保护作用。
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| 红色箭头示正常细胞；黑色箭头示损伤细胞 A：假手术组；B：Pio 1.0组； C：Pio 10.0组；D：T0070907 组；E：T+Pio 1.0组；F：TBI组 |
| 图 1 各组大鼠顶叶皮层脑组织病理变化 (HE) |
| 组别 | 细胞损伤率(%) | 尼氏体脱失率(%) | 细胞凋亡数 |
| 假手术组 | 25.33±9.34ab | 10.56±1.67ab | 21.67±2.08ab |
| Pio 1.0组 | 32.08±9.38ab | 33.33±20.00abc | 24.33±0.57ab |
| Pio 10.0组 | 28.00±1.33ab | 20.00±7.07ab | 25.33±0.57ab |
| T0070907组 | 81.67±16.07 | 57.78±21.08bc | 40.67±1.15 |
| T+Pio 1.0组 | 36.67±7.27ab | 28.89±9.27abc | 28.33±10.50ab |
| TBI组 | 86.67±11.54 | 80.00±17.00c | 41.67±1.53 |
光镜观察结果显示：正常大鼠神经元呈蓝色，多规则排列在细胞核周围，形态大小一致；尼氏体脱失表现为蓝色变浅，多呈现为空泡状。假手术组尼氏体多呈蓝色，空泡较少(图 2A)，尼氏体脱失率约10%(表 2)；T0070907组(图 2D)和TBI组(图 2F)损伤区周围神经元明显减少，大量神经元变形皱缩、尼氏体脱 失，残存的尼氏体颜色较浅，而Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、 Pio 10.0组可见部分尼氏体脱失 (图 2B、C、E)；Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、Pio 10.0组尼氏体脱失率均低于T0070907组和TBI组，差异有统计学意义 (P<0.05，表 2)；Pio 1.0组、T+Pio 1.0组尼氏体脱失率高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05，表 2)；Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、Pio 10.0组3组组间尼氏体脱失率无统计学差异(P>0.05，表 2)；表明低剂量吡格列酮能减轻创伤性脑损伤后的神经尼氏体脱失情况。T0070907组尼氏体脱失率明显低于TBI组 (P<0.05，表 2)，表明T0070907能在一定程度上减轻创伤性脑损伤后的神经尼氏体脱失情况。
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| 红色箭头示正常尼氏体；黑色箭头示尼氏体脱失 A：假手术组；B：Pio 1.0组；C：Pio 10.0组；D：T0070907 组；E：T+Pio 1.0组；F：TBI组 |
| 图 2 各组大鼠顶叶皮层脑组织尼氏染色结果 |
光镜观察显示：TUNEL染色凋亡阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核为蓝色。T0070907组和TBI组损伤区周围可见大量凋亡阳性细胞 (图 3D、F)；而假手术组、Pio 1.0组、T+Pio 1.0组及Pio 10.0组(图 3A、B、C、E)损伤区周围凋亡阳性细胞少于T0070907组和TBI组，差异有统计学意义(P<0.05，表 2)，假手术组、Pio 1.0组、T+Pio 1.0组及Pio 10.0组4组间凋亡细胞数无统计学差异(P>0.05，表 2)，表明低剂量吡格列酮能减轻创伤性脑损伤后的神经细胞凋亡情况，T0070907组和TBI组比较凋亡细胞数无统计学差异(P>0.05，表 2)，表明T0070907对TBI后的细胞凋亡情况无明显影响。
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| ↑：示凋亡细胞 A：假手术组；B：Pio 1.0组；C：Pio 10.0组；D：T0070907组；E：T+Pio 1.0组；F：TBI组 |
| 图 3 各组大鼠顶叶皮层脑组织TUNEL染色结果 |
大剂量Pio 10.0组PPARγ mRNA的表达量最高，与假致伤组、低剂量Pio 1.0组、T+Pio 1.0组、T0070907 组及TBI组比较差异均有统计学意义(P>0.05)；低剂量Pio 1.0组与假致伤组、T+Pio 1.0组、T0070907组及TBI组比较均无统计学差异(P> 0.05)，表明大剂量Pio 10.0组中10.0 mg/kg吡格列 酮能够激活PPARγ受体，而低剂量Pio 1.0组 1.0 mg/kg 吡格列酮不足以激活PPARγ受体(表 3)。
| 组别 | PPARγ mRNA |
| 假手术组 | 1.21±0.54a |
| Pio 1.0组 | 3.55±0.28a |
| Pio 10.0组 | 6.04±0.49bc |
| T0070907组 | 2.65±0.79a |
| T+Pio 1.0组 | 1.66±0.82a |
| TBI组 | 2.05±0.63a |
PPARs属于核激素受体家族，有PPARα、PPARβ、PPARγ 3种亚型，该受体被以吡格列酮 (Pioglitazone)为代表的噻唑烷二酮类(TZDs)配体激活后与PPAR反应元件(PPREs)特定基因的启动子区域结合，从而调控多种基因的转录和表达，参与体内糖脂代谢和细胞的增殖与分化等[13]。TZDs还能有效减轻脑缺血、脊髓损伤、神经退行性疾病和TBI后的炎症反应和损伤[3, 14, 15, 16]。T0070907是PPARγ的抑制剂，对PPARγ具有较高的亲和力和选择性，通过影响PPARγ配体结合域的构象从而抑制PPARγ的活化。
创伤性脑损伤急性期的炎症反应、细胞凋亡、脑水肿等病理过程会导致大量神经细胞死亡，当神经元受到损伤时，尼氏体的变化最为敏感，主要表现为尼氏体溶解和消失[17]。近年来一些研究发现PPARγ激动剂吡格列酮可通过多种途径发挥神经保护作用。Sauerbeck等[4]发现的10 mg/kg吡格列酮能减轻TBI后线粒体功能紊乱、减少脑皮质组织的缺失及本课题前期实验报道的10 mg/kg吡格列酮能够改善TBI后神经功能缺失、可保护神经元、减少尼氏体脱失、减轻脑损伤[18]。Burton等[19]发现PPARγ受体拮抗剂T0070907不能逆转吡格列酮对创伤性脑损伤的脑组织保护作用和抗炎作用，认为吡格列酮的神经保护作用不仅仅存在PPARγ依赖的单一途径；Yi等[16] 发现在创伤性脑损伤的治疗中T0070907不能抑制吡格列酮治疗炎症的作用，认为吡格列酮抑制炎症的作用不依赖PPARγ受体。
大量研究表明大剂量吡格列酮的神经保护作用，但是很少有文献报道低剂量吡格列酮对创伤性脑损伤的神经保护作用，本研究利用改良的Feeney自由落体硬膜外撞击方法建立TBI模型，该方法致伤机制单一、重复性较好[20,21,22]，且本课题前期实验已经利用该方法成功建立TBI大鼠模型100余例。采用HE、Nissl、TUNEL染色方法观察各组脑组织损伤情况后发现TBI后用大剂量(10 mg/kg)吡格列酮治疗创伤性脑损伤可保护神经细胞、减少尼氏体神经元脱失，减少损伤脑皮层周围的神经细胞凋亡，同文献[4, 18]报道一致。本研究还发现用低剂量(1.0 mg/kg)吡格列酮治疗创伤性脑损伤也可保护神经细胞、减少迟发型尼氏体神经元脱失，减少损伤脑皮层周围的神经细胞凋亡。那么低剂量吡格和大剂量吡格列酮列酮神经保护作用的机制是否相同呢？
本实验采用荧光定量PCR法检测各组PPARγ mRNA表达情况后发现仅大剂量吡格列酮 (10.0 mg/kg) 能激动PPARγ受体，低剂量吡格列酮 (1.0 mg/kg)和T0070907均不能激动PPARγ受体；本研究还发现T0070907对TBI后细胞损伤和神经细胞凋亡无明显影响，不能逆转吡格列酮对创伤性脑损伤的脑组织保护作用；同文献[23]报道T0070907对细胞凋亡无明显影响相一致。从而说明低剂量吡格列酮和大剂量吡格列酮的神经保护作用的机制不相同。因此我们推测低剂量吡格列酮能在未激活PPARγ受体的情况下对创伤性脑损伤发挥神经保护作用，即低剂量吡格列酮对创伤性脑损伤的神经保护作用存在非PPARγ依赖途径。
PPARγ途径已被全世界广泛关注，而非PPARγ途径尚未引起注意，且低剂量吡格列酮对创伤性脑损伤神经保护存在非PPARγ依赖途径的机制尚未明确，那么低剂量吡格列酮的作用机制是什么、大剂量吡格列酮是否也存在非PPARγ依赖途径有待我们进一步研究发现，将为吡格列酮运用于临床治疗创伤性脑损伤打下基础。
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