非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)指除外酒精等明确肝损伤因素导致的一组肝代谢性疾病,以弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特征。现我国成人NAFLD 患病率已达到20%[1],已接近高脂饮食为主的西方国家水平[2]。NAFLD已成为全球性的重大公共健康问题;又因NAFLD具有进展为肝硬化、肝功能衰竭及原发性肝癌等严重肝脏疾病的可能性[3],引起人们广泛关注。
MORC2(microrchidia family CW-type zinc finger 2,也称ZCWCC1)在精原细胞分裂、DNA甲基化及异染色质形成过程中发挥重要作用[4, 5, 6],也可在前脂肪细胞中参与能量代谢与分化的调控[7]。肝细胞脂肪变性是NAFLD的病理基础,由于前脂肪细胞的分化过程与肝细胞的脂肪变性过程均有成脂基因激活、脂肪蓄积等共性,故上述发现为我们的研究提供了重要的理论基础。肿瘤抑制蛋白p53可在转录水平触发细胞周期阻滞或凋亡,值得关注的是,最近研究表明p53还可以通过调控脂代谢[8, 9],在NAFLD发生中起重要作用[10, 11, 12] 。
我们在前期研究中发现L02肝细胞在发生脂肪变性时,MORC2蛋白含量下降,提示MORC2蛋白可能参与L02肝细胞的脂肪变性过程[13]。故在前期实验的基础上,我们拟进一步观察MORC2蛋白对L02肝细胞脂肪变性的影响,初步探讨MORC2是否可以通过p53参与肝细胞脂肪变性的发生,以期为NAFLD的发病机制研究提供更多的实验证据。
1 材料与方法 1.1 材料L02肝细胞购于中科院上海细胞库。空载慢病毒及过表达MORC2的慢病毒购自上海生博公司,对照及过表达p53的pCMV-XL5质粒购于Origene公司。胎牛血清、青链霉素、高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶均购于HyClone公司,油酸购于Sigma-Aldrich公司,细胞TG含量测定试剂盒购于北京普利莱公司,蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液及凝胶配制试剂盒购于碧云天公司,兔抗人p53抗体购于Cell signal technologies公司,HRP标记的山羊抗鼠及抗兔抗体、鼠抗人β-actin抗体购自中杉金桥公司,RIPA裂解液及TRIzol试剂、Iipofectamine2000购买于Life techologies公司,反转录试剂盒及SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司,ECL化学发光试剂盒及PVDF膜购自Millipore公司。基因表达谱芯片检测服务由上海康成公司提供。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养L02肝细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养基中,孵箱湿度为95%,温度为37 ℃。根据细胞生长速度于汇合度至90%时传代,取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 L02肝细胞分组及脂肪变性模型的诱导实验分组:①野生型L02肝细胞组(L02-WT组);②转染空病毒的L02肝细胞组(L02-ctrl组);③转染MORC2过表达病毒的L02肝细胞组(L02-MORC2组);再根据是否进行脂肪变性诱导,分为诱导组与未诱导组。
将L02肝细胞以2×105/孔的密度铺于6孔板中,贴壁后用高糖DMEM培养基饥饿24 h。将无游离脂肪酸的BSA按1%的比例用高糖DMEM培养基溶解并无菌过滤,替换6孔板中原培养基。未诱导组细胞以此方案培养,诱导组细胞则向培养基中加入终浓度为0.5 mmol/L的无菌油酸并培养24 h[13, 14, 15]。
1.2.3 慢病毒与质粒转染将培养的L02肝细胞消化计数后按 2×104/孔铺于12孔板中,贴壁后将空载病毒及MORC2过表达病毒分别加至培养基中,同时加入终浓度为8 μg/mL的聚凝胺,混匀后弃去L02培养孔内原先培养基,加入病毒液转染24 h后用浓度为1 μg/mL的嘌呤霉素对细胞筛选,之后换为普通培养基继续培养。对照及过表达p53的pCMV-XL5质粒转染按Life techologies公司Lipofectamine2000说明书进行。
1.2.4 细胞总RNA提取与荧光定量PCR将培养基吸去,按TRIzol试剂说明书进行细胞总RNA提取,并以30 μL体系将RNA反转录为cDNA。随后照TaKaRa定量PCR试剂盒说明书操作进行荧光定量PCR检测,检测体系为25 μL,95 ℃预温5 min,随后进行95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s和72 ℃ 15 s的扩增,共40个循环,最后72 ℃延伸2 min,测定溶解曲线。引物序列:MORC2正义链:5′-GGAGGTTCCTTCTCCCAAAG-TC-3′,反义链:5′-CAGAAACTGCGACACTCCGCTT-3′,产物长度110 bp;p53正义链:5′-CCTCAGCATCTTATCCGAGTGG-3′,反义链:5′-TGGATGGTGGTACA-GTCAGAGC-3′,产物长度128 bp;β-actin:正义链:5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,反义链:5′-GTGA-TCTCCTTCTGCATCCTGT-3′,产物长度132 bp。结果以Ct值表示,用2-ΔΔCt计算基因相对表达量,β-actin为内参。
1.2.5 细胞TG含量测定去除培养基后6孔板中每 孔加入100 μL细胞裂解液,40 min后7 000 r/min 4 ℃离心5 min,取5 μL上清进行蛋白浓度测定,余下的上清在70 ℃水浴10 min后加入显色液并37 ℃孵育10 min,在550 nm处测定光密度[D(550)],按标准曲线计算TG含量后,除以蛋白浓度,得到标化的细胞TG含量。
1.2.6 基因表达谱芯片采用Roche公司NimbleGen 12×135K人类基因表达谱芯片对L02-ctrl组及L02-MORC2组中细胞表达基因进行检测,每组实验重复3次,并基于KEGG数据库,对表达差异基因进行Pathway分析。
1.2.7 细胞蛋白提取与Western blot检测在4 ℃环境下使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行蛋白提取。提取结束后,加入上样缓冲液并煮沸5 min及测 定浓度。照说明书配制SDS-PAGE浓缩胶及10%的分离胶。每孔蛋白上样量为50 μg,以浓缩胶60 V,分离胶110 V的电压进行电泳;并以100 V、70 min的条件进行转膜,8%脱脂奶粉封闭2 h后一抗4 ℃孵育过夜(p53抗体稀释 比例为1 ∶1 000,MORC2为1 ∶5 000,β-actin 为1 ∶1 000),TBST洗膜3次后室温下孵育二抗2 h,再次TBST洗膜,最后ECL显影。以β-actin为内参。
1.3 统计学处理
采用StepOne软件分析qRT-PCR结果,使用Image J软件测量Western blot条带灰度值,数据采用SPSS 18.0软件进行分析,结果以x±s表示,采用t检验进行两组间均数的比较,采用单因素方差分析与LSD法进行多组间均数的比较。
2 结果 2.1 L02肝细胞过表达MORC2的效果鉴定qRT-PCR检测结果显示,MORC2的mRNA相对表达量在L02-WT组与L02-ctrl组中无明显差别[L02-WT组(1.00±0.12)、L02-ctrl组(1.11±0.20),P>0.05],而L02-MORC2组较前两组明显上升[L02-WT组(1.00±0.12)、L02-ctrl组(1.11±0.20)、L02-MORC2组(7.81±1.59),P<0.01]。在Western blot检测中,可见L02-MORC2组的MORC2含量较另两组明显增加[L02-WT组(118.71±2.37)、L02-ctrl组(123.20±3.83)、L02-MORC2组(224.61±10.92),P<0.01]。证明MORC2慢病毒载体构建及转染成功、过表达MORC2的L02肝细胞系成功建立(图 1)。
2.2 过表达MORC2对L02肝细胞脂肪变性的影响我们已在前期实验中对L02肝细胞脂肪变性模型的构建方法及效果进行了鉴定[13, 15]。在未进行脂肪变性诱导培养时,3组细胞的TG含量无明显差异 [L02-WT组(41.84±5.29),L02-ctrl组(45.01±5.51),L02-MORC2组(45.75±6.06),P>0.05]。而经过脂肪变性诱导后,3组细胞的TG含量均较未进行脂肪变性诱导时明显上升,但L02-MORC2组的TG含量上升幅度与L02-WT组及L02-ctrl组相比均明显减少[L02-WT组(180.68±9.04)、L02-ctrl组(180.31±14.88)、L02-MORC2组(115.16±7.59),P<0.01],而L02-WT组与L02-ctrl组之间的TG含量无明显差 别[L02-WT组(180.68±9.04),L02-ctrl组(180.31± 14.88),P>0.05,图 2。以上结果提示过表达MORC2可减轻L02肝细胞在脂肪变性诱导后的TG蓄积程度。
2.3 基因表达谱芯片结果中MORC2可能影响的通路Roche NimbleGen 12×135K人类基因表达谱芯片涵盖了45 033个来自包括NCBI在内的权威数据库的基因。与L02-ctrl组细胞相比,L02-MORC2组中发生变化的、表达差异大于2倍的基因共1 736个。从根据它们进行通路聚类后的Pathway分析结果来看,MORC2可能影响的通路包括Hippo、p53、TGF-β、MAPK及一些肿瘤相关通路(图 3)。
2.4 过表达MORC2对L02肝细胞中p53蛋白水平的影响Western blot检测结果显示,未经脂肪变性诱导时,L02-MORC2未诱导组细胞中的p53蛋白含量低于L02-ctrl未诱导组[L02-MORC2未诱导组(112.65±3.06)、L02-ctrl未诱导组(134.19±4.43),P<0.01];而在脂肪变性诱导后,p53蛋白含量均比未诱导时明显上升,且L02-MORC2诱导组p53蛋白含量仍低于L02-ctrl 诱导组 [L02-MORC2诱导组(194.33±1.80)、 L02-ctrl诱导组(234.69±2.64),P<0.01,图 4。 MORC2可下调L02肝细胞中p53的蛋白水平,进一步提示MORC2减轻肝细胞脂肪变性的作用可能与降低p53表达有关,故我们拟通过上调p53表达,观察是否能减弱MORC2的这种作用。
2.5 L02肝细胞过表达p53的效果鉴定qRT-PCR检测结果显示,在转染对照质粒pCMV-XL5-ctrl时,p53的mRNA的相对表达量在L02-WT组、L02-ctrl组及L02-MORC2组中无明显差别[L02-WT组(1.00±0.15)、L02-ctrl组(1.17±0.24)、L02-MORC2组(1.04±0.22),P>0.05];在转染p53过表达质粒pCMV-XL5-p53时,各组MORC2在转录水平均 较转染对照质粒时明显上升[L02-WT组(1.00±0.15)、(5.57±0.42),L02-ctrl组(1.07±0.24)、(5.47±0.53),L02-MORC2组(0.96±0.22)、(5.19±0.39),P<0.01]。但各组间无明显差别[L02-WT组(5.57± 0.42)、L02-ctrl组(5.47±0.53)、L02-MORC2组(5.19± 0.39),P>0.05]。
Western blot检测结果显示,可见转染对照质粒pCMV-XL5-ctrl的3组细胞中,L02-MORC2组的p53 蛋白水平较L02-WT组、L02-ctrl组降低[L02-WT组(139.54±5.51)、L02-ctrl组(131.28±6.27)、L02-MORC2组(119.63±3.20),P<0.05];转染p53过表达质粒pCMV-XL5-p53时,各组p53的蛋白水平较转染对照质粒时明显上升[L02-WT组(139.54±5.51)、 (236.04±3.90),L02-ctrl组(131.28±6.27)、(234.52± 4.66),L02-MORC2组(119.63±3.20)、(224.02±3.59),P<0.01]。但L02-MORC2组中p53水平较另两组略低[L02-WT组 (236.04±3.90),L02-ctrl组 (234.52±4.66),L02-MORC2组 (224.02±3.59),P<0.05]。进一步提示p53的蛋白含量可被过表达MORC2降低(图 5)。
2.6 过表达p53对MORC2减轻L02肝细胞脂肪变性效应的影响在细胞TG含量测定中,正常表达p53时,L02-WT组、L02-ctrl组、L02-MORC2组细胞经诱导后,TG含量 均较未脂肪变性诱导时明显增加[L02-WT组(43.69±4.31)、(175.50±14.08)、L02-ctrl组(43.46±3.74)、 (171.68±8.47)、L02-MORC2组(46.78±5.85)、(115.69± 7.24),P<0.01],但L02-MORC2组的增加 幅度最小,且与L02-WT组及L02-ctrl组相比,有显著性差异[L02-WT组 (175.50±14.08)、L02-ctrl组(171.68± 8.47)、L02-MORC2组(115.69±7.24),P<0.01]。
在过表达p53时,脂肪变性诱导后L02-WT组、 L02-ctrl组、L02-MORC2组细胞内TG含量均较未脂肪 变性诱导时显著增加[L02-WT组(62.99±3.78)、(240.12± 12.50)、L02-ctrl组(65.52±4.13)、(233.23±3.95)、L02-MORC2组 (61.50±2.51)、(213.68±4.28),P<0.01],但L02-MORC2组与L02-WT组及L02-ctrl组相 比,虽有显著性差异[L02-WT组(240.12±12.50)、L02-ctrl组(233.23±3.95) 、L02-MORC2组(213.68±4.28),P<0.05],但L02-MORC2组的TG含量已明显恢复,并接近L02-ctrl组水平。以上结果提示上调p53后可部分解除过表达MORC2对L02肝细胞脂肪变性的减轻作用,即MORC2减轻肝细胞脂肪变性的过程可能与p53有关(图 6)。
3 讨论Hippo信号通路主要参与肿瘤细胞的增殖[16] ,尚未发现其与脂代谢的联系;TGF-β主要参与细胞增殖、分化的调控[17]。而p53通路作为本基因表达谱芯片中变化最显著的通路之一,且p53与脂代谢关系密切,故我们选用研究p53通路代表分子p53来解释L02肝细胞脂肪变性在过表达MORC2后减轻的现象。
NAFLD发病机制的研究已成为近年来肝病领域的重要热点,但它的机制还未完全阐明。肝细胞的脂肪变性可使肝细胞对损伤因素更为敏感,同时也是向肝脏不可逆损伤进展的关键环节[18]。MORC2是在前脂肪细胞中新近发现的脂代谢调控分子[7],但MORC2的具体调控方式也可能因组织及细胞不同而有所区别[13]。故我们在前期实验的基础上进一步研究MORC2调控肝细胞脂代谢的机制,具有重要意义。
在我们的前期研究中,发现MORC2在L02肝细胞脂肪变性过程中蛋白含量降低,且该下降趋势随脂肪变性程度加重而更为明显[13]。故我们推测MORC2可能参与了L02肝细胞脂肪变性的过程。本实验中我们使用了慢病毒对MORC2进行过表达,发现MORC2可减轻L02肝细胞的脂肪变性,即对L02肝细胞的脂肪变性起保护作用。为寻找可能受MORC2影响的分子或通路,我们进行了基因表达谱芯片检测及Pathway分析。在过表达MORC2后,包括p53在内的多个通路关键分子发生改变。这些结果不仅提示了MORC2功能的多样性,更为我们后续的研究奠定了基础。
Derdak等[19]发现部分抑制p53的活性即可显著减少高脂饮食喂养小鼠的肝脏脂肪变性,认为p53在NAFLD的发展中至关重要;Tomita等[12]对NAFLD模型的p53-/-小鼠及野生型小鼠对比时发现,前者的肝脏脂肪变性减轻;以上研究结果提示p53对NAFLD的形成有重要作用。由于p53是细胞对内外各种刺激的感受分子,无论是NAFLD患者血液中的高水平游离脂肪酸还是脂肪变性诱导中使用的油酸对肝细胞都可以看作是一种刺激因素,故肝细胞中的p53可能在接受游离脂肪酸刺激的过程中发生活化,改变肝细胞的脂代谢稳态并引发肝细胞脂肪变性。而且,我们利用基因表达谱芯片及pathway分析观察到p53通路在过表达MORC2后发生了明显变化。因此,我们倾向用p53通路的代表分子p53来解释MORC2减轻脂肪蓄积的效应。在我们的实验中还发现L02肝细胞中p53的蛋白水平在过表达MORC2后发生下调,同时MORC2也能使脂肪变性诱导后上升的p53蛋白水平得到明显下降,并发现上调p53可部分解除MORC2减轻脂肪变性的效果。我们的这些研究结果进一步提示p53参与了MORC2缓解肝细胞脂肪蓄积的过程。由于p53的蛋白含量主要受泛素-蛋白酶体途径调控,在肝细胞脂肪变性中,p53蛋白与泛素分子结合减少,降解受到抑制,造成了p53蛋白含量的上升,引发TG蓄积等后续效应[20];我们推测,MORC2可能与p53分子结合,改变后者的空间结构,使更多泛素化修饰位点暴露,最终使p53蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解增加、含量降低。但此推测仍需在后续实验中通过IP进行验证。我们也观察到,上调p53并不能完全解除MORC2对脂肪变性的缓解作用,提示在MORC2对脂代谢的调控过程中,仍有其他机制参与,同样需要在后续研究中进一步探讨。由于目前对MORC2的研究仅处于起步阶段,MORC2对脂肪代谢的调控机制仍有许多未知之处需要探索,这也导致了目前尚不能将MORC2的研究成果直接用于临床,需要进一步研究。
本研究发现,过表达MORC2可减轻NAFLD体外模型中L02肝细胞的脂肪变性程度,并可减少此过程中p53的蛋白含量,且上调p53可部分解除过表达MORC2对肝细胞脂肪变性产生的保护效应。结合前期实验及本研究中的结果,我们推测在L02肝细胞脂肪变性过程中,由于MORC2蛋白含量的减少,失去对p53的抑制性调控,使肝细胞脂代谢稳态失衡,发生脂肪变性。我们的研究结果提示MORC2可通过下调p53从而缓解肝细胞脂肪变性,这可能是NAFLD治疗的一个潜在干预靶点,值得深入研究。
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