肾移植是治疗终末期肾病的最有效手段[1],但肾源短缺严重制约了肾移植的发展。心死亡器官捐献(donation after cardiac death,DCD)为解决器官短缺开辟了新的途径[2],但DCD供肾容易遭受长时间热缺血损伤,形成血栓阻碍微循环,导致肾脏灌注不良[3],此类肾脏移植后容易发生原发性无功能(primary nonfunction,PNF)和移植肾功能延迟恢复(delayed graft function,DGF)[4, 5],导致手术失败,肾脏切除。Damman等[6]研究发现长时间热缺血肾脏容易发生补体-凝血途径的激活是造成这类肾脏损伤的重要原因。本研究针对长时间热缺血(warm ischemia,WI)肾脏血栓形成现象,采用尿激酶处理[7],观察其对肾脏结构及功能改善的效能。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物健康成年家兔30只,雌雄不限,体质量1.7~2.4 kg,由第三军医大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(渝)200020002;SCXK(军)20002007,笼养1周后进行实验。
1.1.2 主要实验试剂注射用尿激酶(批准文号:国药准字H12020491)购于天津生物化学制药有限公司,苯巴比妥钠(进口批号:629F031)购于重庆葆光生物公司,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)鼠抗兔单克隆抗体(anti-TM抗体)购于美国Abcam公司。
1.1.3 仪器医用手术器械[上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂],医用高频电刀仪,(GD350-B连续型,上海沪通电子有限公司),Leica徕卡荧光显微镜型号DM6000B(德国徕卡显微系统公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 实验分组30只家兔按随机数字表法分为3组:假手术组、热缺血组(WI组)、热缺血+尿激酶组(WI+UK组)。每组10只家兔。
1.2.2 手术步骤(1)参考周江桥等[8]的方法建立长时间热缺血肾脏自体移植模型:①麻醉:3%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg剂量腹腔注射;以静脉穿刺套管 针行耳缘静脉穿刺,建立静脉通路并固定。100 U/100 g 皮下注射肝素。②游离肾脏:腹部纵行切口,游离左肾,暴露腹主动脉,完全游离左肾动脉、静脉至起始部。③长时间热缺血模型建立:采用无创伤血管夹从肾血管起始部夹闭左侧肾动、静脉,热缺血90 min后选用24#儿科套管针穿刺左肾动脉,以10~15 mL 0~4 ℃的HCA液恒压灌洗(压力为100 mmHg)。根据肾静脉的直径及角度选取适合的套管针穿刺肾静脉引流灌注液,形成肾局部灌注循环通路。灌注过程中自肾周向肾门按摩肾脏,至色泽变白、肾静脉流出液清澈后停止灌注。9-0无创伤显微缝合线于显微镜下缝合肾动脉及肾静脉穿刺口。开放左肾动脉及静脉,使左肾血流复灌。右侧肾脏延迟至术后第30天切除。(2)药物处理:假手术组仅行切开缝合腹部及注射生理盐水,WI组建立模型后注射生理盐水,WI+UK组建立模型后予尿激酶50万U/d,耳缘静脉静滴,连续治疗3 d。
1.2.3 术后处理术后给予青霉素10万U/kg,肌肉注射,每天2次,连用3 d预防感染。术后第30天切除右侧肾脏,移植术后第35天采用急性失血法处死动物,留取血液标本,摘取左肾,行病理检查。
1.3 主要观测数据 1.3.1 肌酐(Cr)取术前30 min和术后第30、35天静脉血检测肌酐水平。术前反映了双侧肾脏正常功能,术后第30天反映健康肾脏代偿情况下肾脏功能,术后第35天反映移植肾脏功能。
1.3.2 病理检测术后第35天取移植肾脏组织行HE、Masson染色。
1.3.3 免疫组化以鼠抗兔anti-TM单克隆抗体(工作浓度1 ∶250)为一抗行免疫组化检测。免疫组化操作按试剂盒说明书进行。在显微镜下观察,免疫组化阳性染色为细胞质内棕黄色颗粒,以正常家兔肾脏组织为阴性对照。免疫组化结果以平均光密度表示[9],具体方法如下:采用Image-Pro Plus软件,分别测定累积光密度(IOD)和面积,计算平均光密度(mean density=累积光密度/面积)。每例标本显微镜下在肾小管区域随机选择6个高倍镜视野(×200),计算平均光密度后,进行统计学分析。
1.4 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件,正态分布数据采用 x±s 表示,非正态分布数据用中位数表示,2组间比较采用两个独立样本的t检验,手术前后肌酐水平比较采用配对样本t检验。
2 结果 2.1 各组Cr水平比较各组肾移植前后Cr水平见表 1。术后第30、35天,WI组和WI+UK组Cr水平明显高于该时间点假手术组(P<0.01),且较各组术前明显升高(P<0.01);移植后第30天WI+UK组Cr水平与WI组比较差异无统计学意义(P>0.05),术后第35天移植肾 脏Cr水平WI+UK组明显低于WI组(P<0.01)。
(μmol/L,n=10, x±s) | |||
组别 | 术前 | 术后第30天 | 术后第35天 |
假手术组 | 68.91±15.19 | 79.82±7.90 | 78.78±9.91 |
WI组 | 65.46±12.14 | 112.30±13.22ab | 165.34±8.38ab |
WI+UK组 | 70.01±6.85 | 98.68±12.58ab | 118.99±17.18abc |
a: P<0.01,与假手术组比较;b: P<0.01,与本组术前比较;c: P<0.01,与WI组比较 |
术后第35天肾脏HE染色和Masson染色见图 1。光镜下:假手术组肾组 织形态结构清晰,肾小管、肾小 球结构正常;WI组肾小球及毛细血管内有明显微血栓,肾小球毛细血管腔皱缩呈缺血样改变,肾小管上皮出现明显的水肿、坏死(图 1A、C);WI+UK组术后第35天肾小球内未见明显血栓,肾小管未见明显异常(图 1B、D)。
2.3 免疫组化观察术后第35天WI组TM表达(43.87×10-5)明显高于假手术组(3.53×10-5,P<0.01)及WI+UK组(3.88×10-5,P<0.01),WI+UK组与假手术组无明显差别(P=0.63)。见图 2。
3 讨论肾脏热缺血损伤后容易形成微血栓,阻碍血流灌注,加重肾脏损伤。国内外临床实践显示DCD供肾质量差,主要原因是热缺血时间长、血栓形成,甚至因此而丢弃肾脏[3]。移植后再灌注损伤会进一步加重肾脏热缺血损伤,血栓形成会致移植肾脏原发性无功能。针对血栓形成这一问题,本研究采取尿激酶进行溶栓治疗,观察其效果。
尿激酶可直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统,能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶,后者不仅能降解纤维蛋白凝块,亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等,从而发挥溶栓作用,故我们选择尿激酶进行溶栓治疗。文献[10, 11]报道,热缺血时间最长达60 min时兔肾脏结构和功能损伤仍可逆,而热缺血90 min时肾脏发生了不可逆损伤,因此本实验选取了热缺血90 min这一时间点,建立长时间热缺血模型。术后延迟切除右侧肾脏以模拟透析治疗,避免发生急性肾功能衰竭,减少动物死亡,提高实验动物存活率[12]。为了观测缺血肾脏真实肾功能,术后第30天切除右侧肾脏。
实验中热缺血后Cr水平升高,特别是WI组术后第35天较术前及假手术组明显升高,说明肾功能降低。尿激酶溶栓后UK组术后第35天Cr水平较假手术组高,即肾脏有一定程度损伤,但明显低于WI组,提示热缺血90 min肾脏经溶栓处理后功能得以改善。WI术后第35天肾小球及毛细血管内大量微血栓存在,肾小管上皮出现明显的水肿、坏死;WI+UK组微血栓减少,肾小管及肾小球形态未见明显异常,说明热缺血90 min后会形成明显微血栓,尿激酶可将其溶解并且促进肾脏结构的修复。TM能够反映血管内皮损伤[13, 14],是血栓前状态标志之一,TM表达水平与血栓形成密切相关。本实验中WI组TM表达明显高于假手术组,提示热缺血90 min后血管内皮细胞损伤严重,容易导致血栓形成;WI+UK组TM蛋白表达水平明显低于WI组,说明溶栓治疗后血管内皮损伤减轻,血栓形成风险减小。以上结果说明:肾脏热缺血 90 min 后血管内皮损伤严重,血栓大量形成,造成严重微循环障碍,导致肾脏结构和功能损害;而尿激酶溶栓后血栓减少,微循环得以改善,肾脏结构和功能恢复。
综上所述,热缺血90 min可形成明显的微血栓,再灌注后会导致肾脏结构破坏及肾功能损害。尿激酶治疗后微血栓溶解,可促进肾脏结构和功能恢复。尿激酶改善了长时间热缺血肾脏功能,为临床应用此类肾脏提供了实验研究。
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