2. 重庆,第三军医大学高原军事医学系:高原特殊药物与装备研究室;
3. 高原医学教育部重点实验室,全军高原医学重点实验室
2. Department of High Altitude Special Drugs and Equipments, College of High Altitude Military Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China;
3. Key Laboratory of High Altitude Medicine of Ministry of Education, Key Laboratory of High Altitude Medicine, College of High Altitude Military Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一种以肺血管重塑为主要病理变化的疾病,其发病机制尚未完全明了[1, 2, 3]。目前认为,肺血管收缩和重塑是缺氧性肺动脉高压形成的主要病理生理基础[4]。在此过程中,肺动脉外膜出现大量的纤维增生,肺动脉成纤维细胞发挥了重要作用[5, 6]。葡萄糖经糖酵解产生ATP是哺乳动物细胞缺氧时的主要能量来源,其经载体跨膜转运进入细胞内是许多细胞糖代谢的限速步骤,葡萄糖转运蛋白家族参与了其跨膜转运这一过程。葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT-1)是葡萄糖转运蛋白家族中最具代表性的成员之一,是组织细胞进行跨膜转运葡萄糖的重要载体[7, 8, 9],其广泛分布于间质组织、红细胞、血脑屏障、胎盘的基底膜和内皮细胞等[10]。在缺氧条件下,成纤维细胞是否通过GLUT-1上调促进葡萄糖转运尚不清楚。本研究拟通过检测GLUT-1的表达,探讨缺氧性肺动脉高压形成过程中早期成纤维细胞葡萄糖摄取的特点,为缺氧性肺动脉高压形成的机制提供新的依据。
1 材料与方法 1.1 材料GLUT-1抗体(Abcam公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG+IgM、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG+IgM、Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(中杉金桥生物有限公司);RNAsimple总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司);cDNA合成及荧光定量产品(宝生物工程有限公司);DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(HyClone公司);胎牛血清(Gibco公司);二甲基亚砜(Sigma公司);其余常规试剂为国产分析纯。超净工作台(苏州净化设备厂);CO2培养箱(NUAIR公司);低氧培养箱(Thermo Scientific科技公司);PCR仪(Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 大鼠肺成纤维细胞的分离培养采用组织块培养法分离培养肺成纤维细胞,取正常SD大鼠肺 组织,置于含有10×104 U/L的氨苄青霉素和100 mg/L 硫酸链霉素的PBS中,反复漂洗3~5次,移至培养皿中去除脂肪和结缔组织,用眼科剪剪成1 mm3左右组织块,用眼科镊将组织块在培养皿上均匀摆置,每小块 间距5 mm左右,用含10%胎牛血清的DMEM、100 U/mL 青霉素、100 U/mL链霉素配制成DMEM完全培养基,每3天换液1次,形成细胞系后,取第3代细胞用于实验。
1.2.2 细胞缺氧细胞以5×105/mL的密度传代培养,常规培养2 d后细胞约占培养瓶底部8%,将细胞分为常氧组和缺氧组(12、24、48 h),常氧组细胞置常规培养箱内(5% CO2)培养,缺氧各组细胞置缺氧培养箱内培养(1% O2,5% CO2,94% N2),在接种细胞后,依次将48、24、12 h组放入低氧培养箱中培养,未放入前均放于常氧培养箱中,常氧组则在常氧培养箱中培养48 h后统一取出测定各指标。
1.2.3 Western blot 检测细胞经Western及IP裂解液裂解后提取总蛋白,用Bradford测定蛋白浓度,变性后取40 μg经12% SDS-PAGE,转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,用小鼠抗大鼠GLUT-1单抗4 ℃孵育过夜,洗膜后加入辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠二抗,室温孵育1 h,ECL显影,用凝胶成像分析系统进行扫描并记录光密度强度。缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在常氧条件下很快会被降解,在缺氧条件能够稳定表达,以其作为急慢性缺氧的标志物。实验结束后,将各条带与同一膜上常氧组第一泳道上的条带进行比较形成相对灰度,以相对灰度值进行统计学分析。
1.2.4 PCR检测mRNA水平使用RNAsimple总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,然后用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA,进行PCR扩增,PCR反应条件:95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、25 s,72 ℃、25 s,72 ℃、3 min,40个循环,通过Ct值计算缺氧组GLUT-1 基因相对于常氧组的变化倍数。采用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测各组GLUT-1 mRNA的表达。GLUT-1:上游引物5′-CGTCCATTCTCCGTTTCA-3′,下游引物5′-GCGGTGGTTCCATGTTTG-3′,208 bp;β-actin:上游引物 5′-GTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3′,下游引物5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGAGGG-3′,245 bp。
1.2.5 免疫组织化学将大鼠皮肤成纤维细胞培养于玻片上,4 %多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗 5 min×3次,5 %山羊血清室温封闭1 h,加入小鼠抗大鼠GLUT-1抗体4 ℃孵育过夜,PBS漂洗5 min×3次,加入山羊抗小鼠IgG,室温孵育1 h后PBS漂洗5 min×3次,DAB显色,苏木精复染,中性树脂封片,显微镜下观察并拍照。
1.2.6 细胞培养上清中葡萄糖含量测定细胞经低糖培养基培养后,进行缺氧处理,按照南京建成葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法,GOD-PAP法)测定细胞培养上清葡萄糖含量。
1.3 统计学方法实验数据以 x±s表示,采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析,组间比较采用非配对样本t检验。
2 结果 2.1 缺氧对肺成纤维细胞形态的影响常氧与缺氧条件下培养的肺成纤维细胞在形态上有明显差别。光学显微镜下,常氧组细胞呈长梭形、放射状生长(图1A),缺氧组细胞体积较大,个别细胞由梭形变为圆形、三角形,且生长速度受到影响,缺氧24 h组和缺氧48 h组尤为显著(图1B~D)。
2.2 肺成纤维细胞缺氧后GLUT-1的蛋白表达量升高Western blot检测结果显示(图2),GLUT-1的蛋白表达随着缺氧时间的延长逐渐增加,缺氧12、24 h和48 h组与常氧组相比较,差异均具有统计学意义(P<0.05),缺氧24 h组与缺氧12 h组差异无统计学意义(P>0.05),缺氧48 h组与缺氧12 h组、缺氧24 h 组相比较,GLUT-1表达显著升高(P<0.05)。免疫组织化学同样检测到GLUT-1表达具有时间依赖性升高趋势(图3)。
2.3 肺成纤维细胞缺氧后GLUT-1 mRNA表达水平升高通过RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳结果显示,GLUT-1 mRNA表达水平随缺氧时间推移逐渐升高,缺氧12 h组与常氧组相比,差异无统计学意义(P>0.05),缺氧24、48 h组均显著高于常氧组(P<0.05),缺氧48 h组显著高于缺氧24 h组(P<0.05),见表1、图4。
缺氧时间(h) | GLUT-1Ct | β-actinCt | △Ct | △△Ct | 2-△△Ct |
0 | 17.418 82 | 12.454 26 | 4.964 563 | 0 | 1 |
12 | 16.016 34 | 12.455 42 | 3.560 923 | -1.403 64 | 2.645 683 |
24 | 16.892 58 | 14.220 42 | 2.672 157 | -2.292 41 | 4.898 726 |
48 | 16.180 22 | 14.553 63 | 1.626 593 | -3.337 97 | 10.111 81 |
各组加入DMEM低糖培养基(葡萄糖糖浓度5.5 mmol/L),经常氧或缺氧处理后,检测细胞培养上清葡萄糖含量发现,缺氧12 h(0.94 mmol/L)、24 h(0.34 mmol/L)和48 h(0.84 mmol/L)组较常氧组(1.63 mmol/L)上清中葡萄糖含量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论葡萄糖的优先利用可以在产生相同分子数ATP时节约用氧,在缺氧习服过程中,围绕“氧/ATP”这一矛盾,机体进行复杂而有序的代谢调整,以适应缺氧环境[11, 12]。本实验结果发现,缺氧12、24、48 h后,大鼠肺成纤维细胞培养上清中葡萄糖含量较常氧组显著降低(P<0.05),因葡萄糖上清含量是在离体下检测的,虽不足以反映成纤维细胞在体时葡萄糖摄取的情况,但是这一指标的变化间接反映了成纤维细胞葡萄糖摄取的能力。这一能力的增强对于缓解“氧/ATP”矛盾,增强成纤维细胞耐缺氧能力具有重要意义。虽然48 h显著高于24 h组上清含量,但这可能与细胞的凋亡或增殖有关(在缺氧48 h后,细胞在形态上和数量上都发生明显变化,图1)。
葡萄糖跨膜转运的过程十分复杂,GLUT-1是葡萄糖转运蛋白家族中最具代表性的成员之一,是组织细胞进行跨膜转运葡萄糖的重要载体[13]。本研究结果显示,当大鼠肺成纤维细胞缺氧12 h后,GLUT-1蛋白表达水平上调,缺氧48 h表达上调更为显著,与免疫组化结果一致。本实验进一步明确了,缺氧时GLUT-1 mRNA的水平随缺氧时间的延长持续升高。Bruckner等[14]研究也发现,脑组织缺氧20 min即可检测到GLUT-1 mRNA水平的升高。但缺氧组GLUT-1蛋白水平的变化先于其mRNA水平,提示这可能与成纤维细胞葡萄糖转运的储备能力有关。
肺血管外膜成纤维细胞增殖和细胞外基质成分堆积是慢性缺氧性肺动脉高压和血管重塑的重要血管病变。有研究证实,缺氧诱导的肺血管重塑需要募集单核/巨噬细胞[5],纤维细胞[15]等血液中循环的间质祖细胞,而成纤维细胞[16]、成肌纤维母细胞[17]等均来源于间质祖细胞。这些细胞产生大量的细胞外基质沉积于血管周围,肺动脉外膜和中膜增厚,动脉管腔直径缩小,肺组织的生物活性和功能表型都发生适应性改变,是造成不可逆性肺血管重塑和持续性肺动脉高压的关键。GLUT-1蛋白在成纤维细胞中调控葡萄糖的转运,是能量供给的“关卡”,缺氧条件下,这些细胞的功能发挥依赖于细胞能量的供给,GLUT-1表达增加导致细胞对葡萄糖的消耗增多,有利于成纤维细胞在缺氧条件下对葡萄糖的利用,从而使得成纤维细胞仍能进行胶原等细胞外基质的合成。本研究发现,在缺氧条件下,肺成纤细胞中GLUT-1的蛋白和mRNA水平均表达升高,培养上清中葡萄糖含量降低。这对于维持成纤维细胞缺氧条件下的能量代谢尤为重要,而成纤维细胞在缺氧肺动脉高压的形成中发挥重要作用。GLUT-1是HIF-1α下游的靶基因,受到HIF-1α的调控,但其具体的机制还不明确,有待进一步实验证明。
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