胆汁淤积是常见的临床综合征，其发病率和诊断率越来越高。多项研究表明，胆汁淤积的发生与肝细胞表面胆汁酸转运蛋白的异常表达密切相关[1, 2]。这些转运蛋白包括：钠依赖牛磺胆酸共转运体(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)、阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)、胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)、多药耐药蛋白2(multidrug resistance-2，MDR2)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)等。近年研究表明：MRP2在调控胆汁酸排泌方面发挥着重要的作用[3, 4]。人类原发性胆小管硬化性胆汁淤积症、Dubin-Johnson综合征等疾病与其减少密切相关。动物实验发现，肝细胞胆管膜面的Mrp2表达降低可导致胆汁淤积[5]。目前，MRP2的表达调控机制并不清楚。已有研究表明，RXRα与法尼酸受体FXR、CAR和孕烷受体PXR形成异二聚体参与MRP2基因转录的调控[6, 7]。
Ezrin(EZR)为细胞膜-细胞骨架连接蛋白，主要表达于上皮细胞，尤其在小肠、胃、肺、胰腺、肾脏、肝脏中高表达[8]。Ezrin主要由3个结构域组成：①氨基端高度保守的球形结构，即FERM区；②α螺旋区；③伸向胞浆的羧基端，其中有一个可与F-action相连接的高度保守的氨基酸序列，而Ezrin的磷酸化位点也位于此区，参与Ezrin蛋白的活化[9]。骨架蛋白EZR主要在肝细胞胆管膜面表达，其异常表达或分布异常将导致细胞正常生理功能的异常。近年研究表明，EZR即能参与细胞的生长和信号转导，有可接受胞外信号，使细胞骨架重排[10]。因此，我们建立了EZR表达缺失的HepG2细胞，并研究其表达缺失对肝细胞胆管膜面的胆汁酸转运蛋白MRP2的影响，旨在为临床治疗胆汁淤积提供新的线索。
1 材料与方法 1.1 材料HepG2细胞购自中科院上海细胞研究所；DMEM培养基、胎牛血清、Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium购自Gibco公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagen、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自Roche公司；Streptavidin Agarose Resins、EZ-Link Sulfo-NSS-SS-Biotin购自Pierce Biotechnology公司；EZR、MRP2购自Epitomics公司；羊抗兔二抗购自Pierce Biotechnology公司；Ezrin-shRNA质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。
1.2 方法 1.2.1 Ezrin-shRNA-HepG2稳转细胞株的建立参考文献[11]的方法,转染Ezrin-shRNA#1、Ezrin-shRNA#2、Ezrin-shRNA#3及Control质粒。操作过程根据X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagen说明书完成。X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagen：DNA复合物=3 ∶1。常规培养细胞24 h，更换新鲜的10% FBS-DMEM培养基并用1 000 μg/mL G418进行阳性筛选7 d后，挑选单克隆稳定转染细胞株，继续用500 μg/mL G418持续筛选3周，获得稳定转染细胞株，扩大培养。提取细胞RNA，筛选出能够有效抑制EZR基因表达的细胞株。
1.2.2 RT-qPCR按TRIzol说明书提取细胞RNA。逆转录为cDNA后进行RT-qPCR扩增。PCR反应体系：20 μL体系中5′端和3′端引物各0.4 μL(10 μmol/L)、dNTPs 1.6 μL(2.5 μmol/L)、Template 1 μL(10 ng/μL)、Taq polymerase 0.2 μL、5×Taq Buffer 4 μL、ddH2O 12.4 μL，反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30个循环，72 ℃ 10 min。引物序列见表1。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) | 长度(bp) |
| MRP2 | 上游:CTCACTTCAGCGAGACCCG下游:CCAGCCAGTTCAGGGGTTT | 191 |
| EZR | 上游:TTGTGGCTTGCTCTGTGCT下游:AACACCGAACGACACACGA | 261 |
| GAPDH | 上游:CCACGAAACTACCTTCAACTCC下游:CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC | 252 |
按EZ-Link Sulfo- NSS-SS-Biotin说明书进行操作。冰冷的PBS液清洗细胞后，6孔板每孔加入1 mL Biotin Solution，4 ℃反应1 h，使膜蛋白充分Biotin化，加入2.5 mL/孔的冰冷反应终止液洗涤2次。按照文献[11]的方法提取总膜蛋白，进行蛋白免疫印迹实验。
1.2.4 蛋白免疫印迹按照文献[11]的方法提取细胞总蛋白，并进行SDS-PAGE电泳，上样量为20 μg/孔。浓缩胶60 V电泳1 h，分离胶100 V电泳2 h，常规湿法转膜80 min，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，一抗(EZR 1 ∶20 000，Na+-K+-ATPase 1 ∶50 000)4 ℃孵育过夜，用TBST吸取一抗后加入相应的二抗(1 ∶50 000)，室温孵育1 h。ECL化学发光，凝胶成像系统显影。
1.3 统计学方法数据以 x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件行t检验。
2 结果 2.1 成功建立并筛选了EZR表达缺失的HepG2细胞稳转细胞株将Ezrin-shRNA#1、Ezrin-shRNA#2、Ezrin-shRNA#3、Ezrin-shRNA#4及control质粒转染HepG2细胞后，筛选稳转细胞。提取各株细胞的RNA，RT-qPCR检测EZR基因的表达情况，结果表明Ezrin-shRNA#3、Ezrin-shRNA#4质粒能够有效抑制HepG2细胞EZR基因的表达(P<0.01)，其中Ezrin-shRNA#3效果最优，抑制率达70%，在后续实验中选择使用Ezrin shRNA#3-HepG2。
2.2 EZR表达缺失对HepG2细胞MRP2总蛋白的表达无明显影响Ezrin shRNA#3-HepG2的EZR mRNA表达缺失最显著，因此，选择提取Ezrin shRNA#3-HepG2细胞总蛋白，检测EZR表达缺失对HepG2细胞MRP2总蛋白的表达影响。蛋白免疫印迹检测结果显示，与对照组相比，Ezrin shRNA#3-HepG2组细胞MRP2表达增高，但差异无统计学意义(图1)。这提示EZR表达缺失对HepG2细胞MRP2总蛋白的表达无明显影响。
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| A: 蛋白免疫印迹检测结果 1：Control-HepG2组；2：Ezrin shRNA#3-HepG2组；B：半定量分析结果 a：P<0.01，与Contorl-HepG2组比较 图 1 蛋白免疫印迹检测MRP2总蛋白在Ezrin shRNA#3-HepG2 中的表达 |
为进一步明确胆汁淤积时EZR蛋白与MRP2蛋白的关系，我们提取生物素化的Ezrin-shRNA#3-HepG2和Control-HepG2细胞的总膜蛋白，检测EZR表达缺失与MRP2膜蛋白的关系。结果表明：与Control-HepG2细胞相比，Ezrin-shRNA#3-HepG2细胞膜表面的MRP2表达量明显增高(P<0.01,图2)，而胞浆中的MRP2膜蛋 白的表达量也明显增高(P<0.01,图3)。表明EZR表达缺失能够明显上调HepG2细胞MRP2总膜蛋白的表达。
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| 1：Control-HepG2组；2：Ezrin shRNA#3-HepG2组 A: 蛋白免疫印迹检测结果；B：半定量分析结果 a：P<0.01，与Contorl-HepG2组比较 图 2 蛋白免疫印迹检测MRP2膜蛋白在Ezrin shRNA#3-HepG2 细胞胞膜上的表达 |
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| 1：control-HepG2组；2：Ezrin shRNA#3-HepG2组 A: 蛋白免疫印迹检测结果；B：半定量分析结果 a：P<0.01，与Contorl-HepG2组比较图 3 蛋白免疫印迹检测MRP2膜蛋白在Ezrin shRNA#3-HepG2 细胞胞浆中的表达 |
MRP2为一种ATP依赖的胆酸转运蛋白，分布于肝细胞胆管膜面，主要以各种胆盐以及利福平、普伐他汀等药物为底物，是维持肝脏正常生理功能的重要蛋白[12]。胆汁淤积时，MRP2表达降低后，机体能够相应地作出适应性反应以代偿MRP2的功能，但是这种代偿功能并不能完全取代MRP2的作用保护肝脏处于正常状态。因此，胆酸转运蛋白MRP2在维持正常的肝细胞功能方面发挥着极其重要的作用。动物模型表明，Mrp2在胆汁淤积发生时其肝脏mRNA、总蛋白水平并未发生明显变化，而肝细胞胆管膜面Mrp2的定位表达却显著减少[13]。这可能提示胆汁淤积下肝细胞胆管面膜MRP2的表达下降主要是转录后调控。但是目前该调控机制尚不清楚。
ERM家族蛋白作为细胞骨架相关蛋白，主要包括EZR、RDX和MSN，是将细胞表面蛋白与细胞内部其他分子之间连接起来的桥梁。EZR又称艾兹蛋白，主要分布在极性化细胞的表面，参与细胞形态维持、运动、黏附、信号传递和生存等多种功能。最近的研究表明，ERM家族具有调节肝细胞表面胆汁酸转运蛋白的作用[14]。在胆道梗阻、药物性肝损、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎等原因引起的胆汁淤积中，均发现EZR蛋白表达下降或分布异常。在肠上皮Caco-2细胞中，骨架蛋白Ezrin还可与Mrp2、F-action相互作用[15]。我们的前期研究表明[11]，该家族的另一成员RDX影响胆酸转运蛋白BSEP在HepG2细胞的定位表达。MRP2属于功能性蛋白，本身不具备运动转移功能。而文献[11]与本研究结果均表明：胆汁淤积时，MRP2在肝细胞胆管膜面的定位表达减少。我们前期关于RDX的研究中并未发现其与MRP2的定位表达具有相关性。因此，我们猜测ERM家族另一锚定蛋白EZR可能与MRP2的定位表达有关。
为了验证该假设，本研究构建了Ezrin表达缺失的HepG2稳转细胞，对MRP2总蛋白进行检测，明确了Ezrin表达缺失对MRP2总蛋白无影响，从而进一步验证了我们关于MRP2转录后调控的推测。而通过生物素化反应检测MRP2膜蛋白的表达变化，则初步确认了在HepG2细胞中，Ezrin表达缺失后，MRP2膜蛋白表达增高。Ezrin为锚定蛋白，主要是通过与其他蛋白形成复合物，促进蛋白在细胞的定位表达，我们怀疑Ezrin表达缺失后，原定位于细胞膜的MRP2蛋白从胞膜解离进入胞浆，从而导致胞浆中MRP2膜蛋白表达增高。因此，该研究为后续研究胆汁淤积时MRP2的转录后调控机制提供了可能的方向。
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