2 全军免疫学研究所
2Institute of Immunology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
目前,世界上大概有3.5亿人感染了乙型肝炎病毒(hepatitis’B virus,HBV),慢性HBV感染是肝硬化、肝衰竭及肝癌的主要诱因[1, 2]。近年来,研究发现免疫损伤是慢性HBV感染免疫损伤的关键环节[3]。CD4+T细胞在免疫反应中起重要作用:它们不仅辅助B细胞与CD8+T细胞,而且本身也产生各种免疫效应功能[4, 5]。而CD4+T细胞是通过HLA-Ⅱ类分子将抗原肽(表位)递呈给TCR受体活化的。HLA-Ⅱ类分子(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP分子)是表达于专职抗原递呈细胞中的糖蛋白,具有高度多态性[6]。HLA-Ⅱ类分子等位决定着HBV的感染、清除及肝癌发生等临床转归,而我们对各HLA-Ⅱ类分子限制的表位肽了解比较少。
到目前为止,在8种HBV基因型中,已发现61个HLA-Ⅰ类分子表位及32个HLA-Ⅱ类分子表位[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13],然而大部分表位源自HBV的A、D基因型,很少源自亚洲最流行的B、C基因型。而HLA-DRB1*0803与HLA-DRB1*0901是慢性HBV感染患者中较常见的HLA-Ⅱ类等位,目前也尚少见相关HBV表位的报道。HBV基因组长度约3.2 kb ,编码包括P蛋白、pre-C及core抗原、S抗原、X蛋白,通过分析core蛋白[14]、S抗原[7]、P抗原[15]及X蛋白[16]引起的特异性的T细胞反应,发现序列高度保守core蛋白引起的T细胞反应最强烈,表明C抗原介导的T细胞反应对免疫损伤起主导作用。
因此,鉴定HLA-DRB1*0803与HLA-DRB1*0901限制的B、C基因型的C抗原表位显得相当重要。时下,鉴定HLA表位的方法有很多,包括生物信息学预测[17, 18],功能实验[19, 20](酶联免疫斑点、流式细胞因子染色),质谱鉴定[21, 22, 23],肽结合实验[24]等。利用合成肽在体外进行功能实验,是鉴定表位的有效方法,但如果肽的数量多,则需利用大量同型HLA患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)或转HLA小鼠模型进行逐条肽实验,复杂且周期长。质谱技术直接鉴定细胞表面HLA-Ⅱ类分子所提呈的HBcAg肽池则显得简单、方便。
本实验主要从HBV pre-core及core抗原肽池负载的BLCL表面(高表达HLA-Ⅱ分子,其中又以HLA-DR含量最多,HLA-DQ次之,HLA-DP最少,三者之比大约为60 ∶10 ∶1[25, 26])分离其结合的多肽[27, 28],进行质谱分析,然后再结合生物信息学方法,最终确定HLA-DR分子的候选表位。
1 材料与方法 1.1 细胞株及主要试剂WATANABE细胞(基因型为DRB1*0803纯合子),购自美国华盛顿大学佛雷德·哈钦森癌症研究中心。本科室培养的BLCL(基因型为DRB1*0901纯合子),1640培养基、胎牛血清、丙酮酸钠购自美国Gibco公司。抗人HLA-DR-PerCP-Cy5抗体购自美国BD公司,抗人HLA-DP-PE抗体购自美国Antigenix公司,抗人HLA-DQ-APC抗体购自Abcam公司。柠檬酸缓冲液:0.131 mol/L柠檬酸,0.066 mol/L磷酸氢二钠,150 mmol/L氯化钠,pH 3.3。0.45 μm及0.22 μm滤器、10×103超滤管购自Millipore公司,C18柱购自Waters公司,乙腈、三氟乙酸TFA购自Sigma公司。
1.2 肽池的合成从NCBI找到乙肝B基因型序列27条和C基因型序列32条,运用BioEdit软件进行多序列比对,去除变异位点,确定pre-core及core蛋白的共有序列长为212个氨基酸。按照每条肽长15个氨基酸,重叠10个氨基酸,确定41条多肽。由上海强耀生物公司合成,100 μg/μL溶于DMSO,储存于-80 ℃。
1.3 细胞的培养BLCL用T25培养瓶在37 ℃,5%CO2的环境中培养,培养基为含有10%的胎牛血清、1%丙酮酸钠的1640培养基。
1.4 BLCL表面HLA-Ⅱ类分子激光共聚焦扫描100 μL 105 B细胞加入HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP 直接荧光抗体,37 ℃避光1 h,PBS洗涤后加入DAPI抗体4 ℃避光5 min,用蒸馏水清洗2次,封片后用激光共聚焦扫描显微镜扫描。
1.5 肽池的负载与收集约5×108BLCL细胞与肽池孵育3 h,每条肽浓度为10 μg/mL,收集细胞后用冷的PBS洗涤2次,去除与细胞表面非特异结合的HBV相关多肽。柠檬酸缓冲液重悬(细胞密度108/mL),室温下孵育10 min(因缓冲液为等渗,pH 3.3,细胞仍保持活性)。离心并收 集含有多肽复合物的溶液。细胞沉淀用冷PBS洗2次 后加入新鲜培养基及肽池,孵育24 h后可重新用上述方法收集多肽复合物。
1.6 多肽复合物的处理收集的多肽复合物用0.22 μm滤器、10×103超滤管去除大分子化合物,过C18柱,并用1%的三氟乙酸洗涤C18柱,之后用80%乙腈将所要的多肽洗脱下来。多肽经过真空浓缩至30 μL后进行液质联用质谱(LC-MS)分析。
1.7 NetMHCⅡpan 3.0 Server工具预测选取质谱评分(IonScore)≥20[29, 30]的多肽序列逐条以FASTA格式粘贴到http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCⅡpan/后,选择其多肽长度及相应HLA等位对其亲和指数(IC50)进行预测。一般认为IC50≤50,结合力很强;50<IC50≤500,结合力一般;500<IC50≤5 000,结合力弱;IC50>5 000则认为没有结合力[23, 30] 。HLA-Ⅱ类分子所结合肽的长度为9~25个氨基酸,通过选定IonScore≥20且IC50≤500的多肽,分析多肽来源(来源于肽池中的哪条肽)。
2 结果 2.1 BLCL表面HLA-Ⅱ类分子的表达BLCL细胞用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP直接荧光抗体染色后的扫描结果见图 1,可见BLCL细胞系表面同时表达HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP分子。
2.2 质谱分析结果质谱分析的数据在Swissprot数据库中选择other virus为模板进行搜索,得到HBcAg多肽。其中来自于基因型为HLA-DRB1*0803的BLCL细胞有长度为5~15个氨基酸的多肽177条,来自于基因型为HLA-DRB1*0901的BLCL细胞有长度为6~15个氨基酸的多肽161条。图 2、3是上述多肽在HBV pre-core及core抗原序列的覆盖率。
2.3 NetMHCⅡpan 3.0 Server预测结果因HLA-Ⅱ类分子所结合肽的长度比HLA-Ⅰ类分子长,选取长度>9个氨基酸且IonScore≥20的多肽进行预测,发现基因型为HLA-DRB1*0803的BLCL细胞表面分离得到的 HBcAg多肽中IC50≤500的有20条 (表 1);基因型为HLA-DRB1*0901的BLCL细胞表面分离得到的HBcAg多肽中IC50≤500的有14条(表 2)。分析上述多肽来源,最终确定HBV相关的HLA-DRB1 ∶0803限制性表位肽8条,HLA-DRB1 ∶0901限制性表位7条,其中相同的有4条(表 3)。
序号 | 肽序列 | 长度 | IC50 (nmol/L) | IonScore | 肽池来源 |
1 | LVVSYVNVNm*GLK | 13 | 144.61 | 63 | RELVVSYVNVNMGLK |
2 | IRDLLDTASALYREA | 15 | 278.83 | 50 | IRDLLDTASALYREA |
3 | DLLDTASALYREA | 13 | 434.77 | 47 | IRDLLDTASALYREA |
4 | VSFGVWIRTPPA | 12 | 341.32 | 46 | FGVWIRTPPAYRPPN |
5 | FGVWIRTPPAYRPPN | 15 | 28.85 | 40 | FGVWIRTPPAYRPPN |
6 | NMGLKIRQLL | 10 | 218.6 | 38 | NMGLKIRQLLWFHIS |
7 | SFGVWIRTPPA | 11 | 499.82 | 32 | EYLVSFGVWIRTPPA |
8 | VVSYVNVNm*GLK | 12 | 186.14 | 32 | RELVVSYVNVNMGLK |
9 | NMGLKIRQLLW | 11 | 137.27 | 32 | NMGLKIRQLLWFHIS |
10 | DFFPSIRDLLDTASA | 15 | 457.15 | 28 | DFFPSIRDLLDTASA |
11 | NmGLKIRQLL | 10 | 185.2 | 27 | NMGLKIRQLLWFHIS |
12 | NmGLKIRQLLWF | 12 | 81.41 | 26 | NMGLKIRQLLWFHIS |
13 | VNVNMGLKIRQLL | 13 | 45.56 | 27 | SYVNVNMGLKIRQLL |
14 | VVSYVNVNMGLK | 12 | 163.15 | 25 | RELVVSYVNVNMGLK |
15 | NVNMGLKIRQ | 10 | 465.06 | 25 | SYVNVNMGLKIRQLL |
16 | WIRTPPAYRPPN | 12 | 144.26 | 25 | FGVWIRTPPAYRPPN |
17 | GVWIRTPPAYRPPN | 14 | 36.59 | 24 | FGVWIRTPPAYRPPN |
18 | LPSDFFPSIRDLL | 13 | 488.57 | 24 | SFLPSDFFPSIRDLL |
19 | RELVVSYVNVNm*GLK | 15 | 133.33 | 23 | RELVVSYVNVNMGLK |
20 | VNMGLKIRQLL | 11 | 100.11 | 21 | SYVNVNMGLKIRQLL |
m*:Met氨基酸的氧化修饰 |
序号 | 肽序列 | 长度 | IC50 (nmol/L) | IonScore | 肽池来源 |
1 | RELVVSYVNVNMGLK | 15 | 447.98 | 56 | RELVVSYVNVNMGLK |
2 | DPYKEFGASVELL | 13 | 355.76 | 55 | DIDPYKEFGASVELL |
3 | FGVWIRTPPAYRPPN | 15 | 59.92 | 49 | FGVWIRTPPAYRPPN |
4 | RELVVSYVNVNm*GLK | 15 | 454.14 | 48 | RELVVSYVNVNMGLK |
5 | DIDPYKEFGASVELL | 15 | 295.02 | 47 | DIDPYKEFGASVELL |
6 | IDPYKEFGASVELL | 14 | 295.12 | 44 | DIDPYKEFGASVELL |
7 | FGVWIRTPPAYRPP | 14 | 68.75 | 32 | FGVWIRTPPAYRPPN |
8 | SVELLSFLPSDFFPS | 15 | 341.83 | 29 | SVELLSFLPSDFFPS |
9 | WIRTPPAYRPPN | 12 | 357.75 | 28 | FGVWIRTPPAYRPPN |
10 | GVWIRTPPAYRPPN | 14 | 81.09 | 26 | FGVWIRTPPAYRPPN |
11 | SYVNVNMGLKIRQLL | 15 | 284.9 | 25 | SYVNVNMGLKIRQLL |
12 | RDLLDTASALYREA | 15 | 352.52 | 24 | IRDLLDTASALYREA |
13 | IRDLLDTASALYREA | 15 | 295.63 | 22 | IRDLLDTASALYREA |
14 | KEFGASVELLSFLPS | 15 | 294.88 | 20 | KEFGASVELLSFLPS |
m*:Met氨基酸的氧化修饰 |
已知HLA-Ⅱ类表位 | HLA-DRB1*0803表位 | HLA-DRB1*0901表位 |
HBc1-20 | HBc2-16 | |
HBc7-21 | ||
HBc18-27 | HBc12-26 | |
HBc17-31 | ||
HBc22-36 | ||
HBc27-41 | HBc27-41 | |
HBc28-47 | ||
HBc50-69 | ||
HBc82-96 | HBc82-96 | |
HBc87-101 | HBc87-101 | |
HBc92-106 | ||
HBc111-125 | ||
HBc117-131 | HBc117-131 | |
HBc120-139 | HBc122-136 | HBc122-136 |
HBc147-156 | ||
已知表位序列如与我们发现的表位是互相包含的关系则认为是同一表位,如只是部分重叠则认为是不同的表位 |
HLA-Ⅱ类分子等位与HBV转归密切相关,而我们对HLA-Ⅱ类分子通过哪些HBV肽段影响机体免疫所知有限。大多数HLA-Ⅰ类分子(如HLA-A2、A11、A24、A33[31]等)因有动物模型,所以可以很方便地用合成肽在体外直接进行功能实验,对其限制性表位已研究得比较透彻。我们所研究的HLA-Ⅱ类分子缺乏动物模型,其研究进展很缓慢。因缺乏动物模型,且同型HLA慢性HBV患者的PBMC有限,对数量庞大的肽池进行逐条实验比较困难。在体外用合成肽进行MHC-Ⅱ分子做结合实验[24],需要先从BLCL中提取相应的HLA-Ⅱ类分子,并用指定肽与放射性标记高亲和力肽竞争性结合来检测指定肽与HLA分子亲和力,其方法比做功能实验要简单一点。
本研究不需要从BLCL中提取HLA-Ⅱ类分子,直接用全肽池与BLCL表面的HLA-Ⅱ类分子做结合实验(等渗酸性溶液处理,细胞活力不受影响,可重复使用[27, 28]),再用质谱检测出其所结合的是哪些肽来鉴定,是最简便的方法。虽然BLCL表面高表达HLA-Ⅱ类分子中,除HLA-DR分子,还表达HLA-DQ、HLA-DP分子,但HLA-DQ、HLA-DP分子虽与HLA-DR分子类似,但因其表达量少[25, 26],对结果影响较小。当然,为保证结果的可信性,我们结合了生物信息学的方法(NetMHCⅡpan 3.0 Server预测),对长度为5~15个氨基酸的HBcAg多肽(合成肽长度为15个氨基酸,所以检测出来不超过15个氨基酸)逐条进行预测。
结合NetMHCⅡpan 3.0 Server预测(IC50≤500[23, 30])及IonScore≥20[29, 30],我们确定了HLA-DRB1*0803限制性多肽8条:HBc17-31、HBc22-36、HBc27-41、HBc82-96、HBc87-101、HBc92-106、HBc117-131、HBc122-136,HLA-DRB1*0901限制性多肽7条:HBc2-16、HBc7-21、HBc12-26、HBc27-41、HBc82-96、HBc87-101、HBc122-136,其中相同的有4条。目前,已知HLA-Ⅱ类分子限制性的HBcAg抗原表位有8条[8],HBc1-20、HBc18-27、 HBc28-47、 HBc50-69、HBc111-125、HBc117-131、HBc120-139、HBc147-156。本研究发现的表位不仅进一步确认已知的HBcAg抗原表位HBc1-20、HBc18-27、HBc117-131、HBc120-139(如已知的HBc18-27表位,该表位对HLA-Ⅰ类分子及HLA-Ⅱ类分子都能引起免疫反应;本研究HLA-DRB1*0803限制性多肽HBc17-31,HLA-DRB1*0901限制性多肽HBc12-26均包括HBc 18-27序列),而且还发现HBc7-21、HBc22-36、HBc27-41、HBc82-96、HBc87-101、HBc92-106新的表位。
此外,除分离收集到HBcAg相关多肽外,我们还发现其他病毒(EBV病毒等)多肽、人自身抗原肽,其中人自身抗原肽达600余条,大部分来源于如热休克蛋白、转铁蛋白受体蛋白1、组织蛋白酶D、 基质金属蛋白酶抑制剂等数十个蛋白。对未来研究其他病毒感染、自身免疫性疾病所涉及的抗原表位有一定的帮助。
当然,本研究发现的表位能不能引起T细胞应答还不一定,只能是潜在候选表位,存在假阳性。因为即使该候选表位能与MHC分子有效结合,也不能代表能与T细胞TCR受体结合。因此,要真正确立特征HLA-Ⅱ类分子的表位,还需要进一步用同型HLA慢性乙肝患者的PBMC来验证其是否有T细胞应答。
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