视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)、干性老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、Stargardt’s病等视网膜变性类疾病常常累及多种视网膜细胞，如感光细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞等，引起其变性或死亡，进而导致患者视力减退甚至失明^{[1, 2]}。目前为止尚无治疗此类疾病的有效措施，细胞移植被认为是最有前景的治疗手段，但其中合适种子细胞的选择这一关键问题仍未得到较好解决。

c-kit是原癌基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白受体，同时也称作CD117，该蛋白具有酪氨酸激酶活性，其配体为干细胞因子(stem cell factor,SCF)。c-kit基因表达产物及SCF是人类多种组织细胞生长发育的重要调控因素。现已证明，c-kit/SCF信号通路在造血细胞、黑色素细胞、眼睫状上皮细胞等的生长、增殖、分化中起到关键作用^[3]。另外、文献^{[4, 5]}报道器官来源的c-kit+干细胞具有自我更新，克隆形成和多分化潜能，在体移植表现出器官特异性。

SSEA已经证实存在于ESCs 及内细胞群细胞表面,可作为未分化细胞的表面标志。在人类主要包括SSEA-3、SSEA-4，但SSEA-3在体外培养早期阶段即迅速消失，SSEA-4则表达较长时间^[6]。

Sasai等^{[7, 8]}在体外相继利用mESC、hESCs三维培养形成类似于小鼠及人正常发育中的视泡样(optic vesicle，OV)及视杯样(optic cup，OC)结构，为眼发育及眼部疾病治疗研究提供了极好的模型。由于hESCs具有向各个胚层分化的潜能，hESCs来源三维培养组织可能包含各胚层细胞，且不同批次三维培养组织分化程度亦存在差异，因此我们通过流式细胞仪筛除其中 SSEA-4⁺的未分化细胞^[9]，以减少其成瘤性风险。Koso^[10]曾报道小鼠视网膜发育中c-kit、SSEA-1的时空变化规律,但有关人类视网膜发育中c-kit、SSEA-4的表达规律及作用的研究尚少见报道，本研究通过对三维培养不同阶段组织中c-kit、SSEA-4抗原进行免疫荧光鉴定及流式细胞仪检测，从而明确其时空变化规律，同时为眼治疗种子细胞合适时间窗的选择奠定理论基础。

hESCs即H1细胞系为协和医学院黄粤教授提供，采用无饲养层贴壁培养体系。

H1细胞系所用培养基为mTeSR(Stem Cell)；三维培养分化培养基为：G-MEM基础培养基(Gibco)+20%血清替代物(KSR，Gibco)+0.1 mmol/L非必需氨基酸(Sigma)+1 mmol/L丙酮酸盐(Sigma)+0.1 mmol/L 2-疏基乙醇(Sigma)；三维培养长期培养基：D/F12- glutamax培养基(Gibco)+10%胎牛血清(FBS，Gibco)+1% N2(Gibco)+ 0.5 μmol/L视黄酸(Sigma)+1%青链霉素(PS，HyClone)。

其他主要试剂：Y27632、Acctuase、CS10、IWR-1、c-kit 抗体均购自Sigma 公司，H1细胞所需基础D/F12购自Gibco公司,H1包被Matrigel、growth-factor-reducedMatrigel、流式SSEA-4抗体均购自BD公司，TrypLE Express购自Invitrogen公司，DnaseⅠ购自stem cell公司,CHIR99021购自R&D公司,SAG购自Enzo Life Sciences公司；SSEA-4、Pax6、Mitf、Rax、Crx抗体购自Abcam公司，流式APC Mouse IgG1同型对照抗体、APC抗人c-kit抗体均购自Biolegend公司。

传代或复苏时，将Matrigel用D/F12 1 ∶100稀释，于37 ℃提前包被孔板至少30 min，第0天培养基中添加10 μmol/L Y27632，然后置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中，每天换液，待密度约80%时可进行传代、冻存或三维诱导分化。传 代、冻存时Acctuase 37 ℃消化约3 min，200×g、20 ℃离心3 min，弃上清重悬，以(4.2～5.2)×10⁴/cm²传代，冻存体系多为(5～8)×10⁵/(500 μL CS10+10 μmol/L Y27632)。

去除培养基，DMEM/F12 迅速洗2遍，添加Tryple Express、0.05 mg/mL DNase I、 10 μmol/L Y-27632，37 ℃消化3 min。1 mL加样器轻轻吹打克隆球，使其从孔板底部脱落并成单细胞状态，移入15 mL离心管，加入3 mL分化培养基终止消化。200×g、20 ℃离心3 min，弃上清，加入3 mL分化培养基重悬后细胞计数。按每孔1.5×10⁴/100 μL种 于V底96孔板(Sumitomo Bakelite)，同时添加20 μmol/L Y-27632，然后置于37 ℃、 5%CO₂细胞培养箱中，其他具体培养细节参照Nakano等^[8]发表的相关文献。

取三维培养不同时间的组织，用PBS迅速漂洗2遍，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋，采用常规石蜡切片法制片，厚约5 μm。二甲苯脱蜡15 min×2次，酒精梯度水化各10 min，柠檬酸盐溶液抗原修复，PBS漂洗5 min×3次；pax6、mitf、Rax等胞内表达抗原经0.25% Triton室温穿透10 min，PBS漂洗5 min×3次，5%山羊血清37 ℃封闭0.5 h，c-kit、SSEA-4为胞膜表达抗原无需穿透直接封闭，然后添加一抗4 ℃过夜；37 ℃复温1 h，PBS漂洗5 min×3次，加入对应荧光标记二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次；DAPI染细胞核，再PBS漂洗5 min×3次；最后加入防荧光淬灭液封片，晾干后行激光共聚焦照相。

三维培养组织经PBS洗2遍，添加Acctuase后转移至圆皿，解剖显微镜下用1 mL空针将其剥离成小块，之后转移至37 ℃消化，每5 min吹打1次，大部分组织消化成单细胞后，等量PBS终止消化，40 μm细胞筛网(BD)过滤后细胞计数，1 100 r/min离心4 min，弃上清后PBS重悬至细胞密度为1×10⁶/100 μL，并分为空白、同型对照、7-AAD、c-kit、SSEA-4及样本组(c-kit、SSEA-4抗体双标)。4 ℃孵育30 min，每5 min震荡1次，之后PBS漂洗2遍，1 100 r/min离心4 min，弃上清后PBS重悬细胞至500 μL，流式细胞仪检测c-kit⁺、SSEA-4⁺及c-kit⁺/SSEA-4^-率。各时间点数据重复3次。

数据经过SPSS 13.0软件处理，采用one way ANOVA分析方法进行检测，结果以x±s表示。

H1细胞因受Y-27632影响第1天胞体呈长梭形， 去除后胞体缩回呈集落样生长，第4～5天相邻集落逐 渐融合(图 1A、B)。三维培养第1天可见细胞沉积于
底部，但细胞结合较松散，且周边可见少量散细胞(图 1C)。第6～11天可见细胞逐渐形成结构致密、形态规则的拟胚体(embryoidbodies，EBs)(图 1D)，此期为EBs期。第12～18天约50%的EB可形成折光性较强类OV样结构，这标志着三维培养进入OV期(图 1E、F)。继续培养至第19～24天，约20% OV可形成由外侧RPE上皮和内侧NR上皮组成的双层杯 凹状结构，类似眼睛正常发育过程中的OC(图 1G、H)。

A：H1细胞传代第1天呈联网状生长，胞体长梭形；B：H1细胞第4天呈集落样生长，部分相邻集落融合；C、D、E、G: 分别为三维培养聚集期细胞团、EB、OV、OC；F、H：分别为E、G白框所示OV、OC局部放大图像 图 1 倒置显微镜观察H1细胞及三维培养组织不同阶段变化

图选项

三维培养第14天可见大部分细胞呈现Rax⁺的OV状结构，提示hESCs已定向分化为眼前体细胞。至第30天则形成具有内层Pax6⁺、外层Mitf⁺的典型双层杯状结构，提示已成功诱导分化出具有内NR层及外 RPE层的类OC状结构。至第90天，可见部分Crx⁺细胞，提示OC可进一步分化为感光前体细胞。见图 2。

A～C：三维培养第30天OC Mitf、Pax6抗体染色，虚线示OC样结构；D、E：三维培养第14、30天OV Rax抗体染色，虚线示OV样结构；F：三维培养第90天OC Crx抗体染色 图 2 三维培养组织免疫荧光鉴定结果

图选项

免疫荧光鉴定结果显示三维培养第7～90天，c-kit⁺率均处于较低水平，但相比之下，第14、21天 c-kit⁺ 率仍较高。与c-kit不同，SSEA-4⁺细胞比例则在第7～49天逐渐下降，之后一直维持于较低水平。在空间分布方面，各时间点c-kit⁺细胞均主要存在于NR上皮层，SSEA-4则早期均匀表达于整个组织，随诱导分化时间延长，其中间区域表达量逐渐减少，后期主要集中于周边部组织。见图 3。

箭头示c-kit+细胞 图 3 三维培养组织不同时间c-kit、SSEA-4免疫荧光鉴定结果

图选项

三维培养第0～90天，流式细胞仪检测结果显示：c-kit⁺率呈先增高后下降趋势，第0天约为10%，之后逐渐上升并在第14天达高峰值40%，其与第0、7天相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。后又持续下降至第49天的1%，并至第90天一直维持于该低水平，与第14天的40%相比统计学差异显著(P＜0.01)，但第49、70、90天c-kit⁺率差异无统计学意义。c-kit⁺/SSEA-4^-率表现出与c-kit⁺率一致的趋势，即 第14天达高峰值约35%，与第0天相比具有统计学差异(P＜0.01)。至第49天下降为约1%，并一直维持至第90天，同样第49、70、90天差异无统计学意义。但SSEA-4⁺率则从第0天的90%一直下降至第49天的1%并维持至第90天，第0、7、14天SSEA-4⁺率两两相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，第14、21、30、49、70、90天SSEA-4⁺率两两相比无统计学差异(图 4、5)。

图 4 三维培养组织各时间c-kit、SSEA-4表达率流式细胞仪检测结果

图选项

图 5 三维培养组织各时间点c-kit+、SSEA-4+、c-kit+/SSEA-4-率表达变化 (x±s，n=3)

图选项

器官来源c-kit⁺干细胞具有自我更新，克隆形成和多分化潜能。肺脏及肾脏来源c-kit⁺干细胞均可跨胚层分化，并形成血管细胞，在体移植后均表现出器官特异性。Das等^[3]发现c-kit信号与人脉络膜睫状体上皮(ciliary epithelium，CE)来源神经干细胞(neural stem cell,NSC)的增殖、分化等有关。Koso等^[10]认为c-kit、SSEA-1可作为小鼠视网膜祖细胞的相关标志物，并且证实c-kit与小鼠视网膜发育密切相关。但人类视网膜发育中相关指标表达规律及作用的研究尚少见报道，三维培养hESCs来源OV样、OC样组织可体外模拟人类眼睛及视网膜发育过程，本研究通过研究该模型中c-kit、SSEA-4的时空表达特性，间接阐述人类视网膜发育中的相关机制，并为寻找合适的人视网膜祖细胞提供理论依据。

实验结果显示，三维培养诱导分化中，约50%EBs进入OV期，随诱导分化时间延长，Rax+OV状结构可逐渐形成典型双层杯凹状结构，即具有Mitf+外侧RPE层及Pax6+内侧NR层的OC状结构，这些均与Nakano^[8]的报道基本一致。

另外可见c-kit主要表达于OV状、OC状组织的NR样结构中，呈先升高后下降趋势，并在第14天达高峰值40%；SSEA-4早期高表达于整个组织，后逐渐下降并低水平维持于周边部。这与Koso^[10]的结果相一致，即从胚胎第14天(E14)至出生后第13天(P13)，小鼠视网膜中c-kit在P1达高峰，SSEA-1则主要表达于不成熟的视网膜祖细胞并逐渐下降。但本实验中，各时间点免疫荧光鉴定c-kit⁺率低于流式检测结果，推测原因可能为：(1)免疫荧光鉴定抗体与流式抗体类型不同，因此二者结果存在一定差异；(2)单个EB可获得约40张切片，且其中OV或OC样结构分布不均匀，因此单张切片染色结果代替整体存在一定偏倚和误差。尽管如此，但二者中c-kit表达趋势仍一致，即随诱导分化时间延长，都呈先升高后下降趋势。

本实验三维培养OV期EBs强表达Rax抗体，提示其启动向眼前体发育的机制。在神经系统的发育中，c-kit信号对神经嵴祖细胞的生长、迁徙、增殖、分化起到重要作用^[11]。Das^[3]也曾报道c-kit信号通过影响Notch1信号通路的表达，在人CE-NSC的分化中发挥作用。本研究结果显示在诱导分化第14天c-kit表达增高，提示EBs向OV样组织分化阶段伴随c-kit基因的激活及表达，然而其具体机制仍待进一步研究。

同时，随三维诱导分化时间延长，大部分hESCs向OV样及OC样组织定向分化，未分化细胞逐渐减少，因此SSEA-4表达率逐渐降低，与之前文献^[10]报道一致。这些均说明hESCs来源三维培养组织早期大部分细胞处于未分化阶段，后在多种诱导因子作用下才向OV样、OC样结构定向分化发育。

我们还发现c-kit⁺/SSEA-4^-细胞比例与c-kit⁺率变化趋势一致，即第14天时达峰值约35%，之后一直下降。但此时由于三维培养组织仍处于OV期，即类似人眼前体期^[12]，针对视网膜变性类疾病，OC期的视网膜祖细胞是更适合移植的种子细胞来源，并猜测OC样组织来源c-kit⁺/SSEA-4^-细胞可能为器官特异性祖细胞，在眼内微环境诱导下可分化为感光、RPE及神经节细胞等多种视网膜细胞，但这些都需要后续实验进一步研究证实。