2.510515 广州,南方医科大学 基础医学院医学遗传学教研室
3.510515 广州,南方医科大学 华银医学检验中心
多重PCR是在同一检测体系中包含2对以上的引物,同时扩增多个目的DNA片段的PCR反应,快速高效和低检测成本,目前广泛应用于临床检测,如地中海贫血[1]、杜氏型肌营养不良、Y染色体微缺失[5]等基因检测项目。从一般PCR到多重PCR,其实验设计难度也大大增加。由于各扩增反应间相互竞争、引物结构与浓度、DNA模板二级结构等多方面的因素,必须对检测体系及反应条件进行一系列优化调整,尽可能使各PCR反应的扩增效率基本一致而保证各目的DNA片段的检出。因此,科研工作者一直致力于采用有效的方法和策略,提高多重PCR体系中各PCR反应的扩增效率,简化优化步骤。本研究设计了一种加尾引物多重PCR策略,以低退火温度预扩增结合后续高退火温度PCR扩增,可明显降低引物及模板二级结构对扩增效率的影响,简化多重体系优化。Y染色体AZF(无精子因子,azoospermia factor) 区域微缺失分析,目前常规采用的即为多重PCR方法[2, 3, 4, 5, 6]。本研究即以AZF 15个特异性序列标签位点(sequence tagged site,STS)为扩增子,应用此策略,设计对应的5′端加尾引物,建立一种Y染色体微缺失多重PCR检测方法,并验证加尾引物多重PCR策略的有效性与实用性。现报告如下。
1 材料与方法 1.1 样本与试剂2014年8月,于华银医学检验中心进行Y微缺失检测的样本18例,均为男性,EDTA-K3抗凝全血,传统酚氯仿法抽提基因组DNA(gDNA),均已用亚能(深圳)生物技术有限公司提供的Y染色体微缺失检测试剂盒(含15个STS位点),严格按照试剂盒操作说明书进行检测,其中阴性样本13例,微缺失阳性样本5例,作为方法学研究的已知基因型样本。另收集2014年8-12月,于华银医学检验中心进行Y 染色体微缺失检测的EDTA-K3抗凝外周全血样本112例,传统酚氯仿法抽提gDNA,作为方法学对比验证样本。
Taq DNA聚合酶及配套PCR Buffer、dNTPs均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR仪为ABI Veriti(美国ABI公司)。
1.2 加尾引物多重PCR策略本研究设计的加尾引物策略,是根据待扩增的gDNA目的序列,分别设计上下游引物(Tm值为55~60 ℃);然后再于引物的5′端,再加上4~6个与gDNA非互补碱基,将整条引物的Tm值提高10~15 ℃(Tm 值为68~70 ℃)。以此引物特点,再设计相应的PCR扩增条件,检测体系的技术原理即为:gDNA 模板 95 ℃ 变性后,于较低的退火温度(即引物与gDNA模板互补序列的Tm值,55~60 ℃),引物与gDNA模板结合、 延伸,经2~4个循环,即实现对原始gDNA模板目标序列的预扩增。紧接着,以稍低的变性温度(92 ℃ )对预扩增的DNA模板变性;再采用稍高的退火温度(即整条引物所有序列的Tm值,68~70 ℃),此条件下引物只结合与之完全互补的预扩增PCR产物DNA模板,完成对目的片段的PCR扩增检测。
1.3 引物设计以文献[5]及NCBI数据库STS位点信息,按4个多重PCR检测体系,将AZF区域15个STS位点为扩增子,根据1.2所述策略设计加尾引物。每反应管的STS位点及引物序列见表 1。
检测管 | STS | 正向引物序列(5′→3′) | 反向引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) |
TCa | sY14 | ccagcAATATTCCCGCTCTCCGGA | ccaacGCTGGTGCTCCATTCTTGAG | 479 |
1 | sY254 | gccacGGGTGTTACCAGAAGGCAAA | gccacGAACCGTATCTACCAAAGCAGC | 390 |
1 | sY143 | cggaggTGCAGGATGAGAAGCAGGTAG | ccacGCCGTGTGCTGGAGACTAATC | 323 |
1 | sY242 | ccatcGCACAGTAGCAGCGGGAG | gcccacTCTGCCACTAAACTGTAAGCTCC | 245 |
1 | sY255 | ccgacGTTACAGGATTCGGCGTGAT | ccaacCTCGTCATGTGCAGCCAC | 134 |
2 | sY84 | gaccacGAAGGGTCTGAAAGCAGGT | gccaccAAGCCTACTACCTGGAGGCTTC | 341 |
2 | sY239 | gccaacCATTCATCTTCCCTTTTGAAGG | gccaacCATTTATGCAAGTCACAGGAAATCT | 218 |
2 | sY152 | cgcaGAAAGACAGTCTGCCATGTTTCA | gccaccTTTGACAGGAGGGTACTTAGCAGT | 141 |
3 | sY86 | gcatcGGGTGACACACAGACTATGCTTC | gcacCACACACAGAGGGACAACCC | 330 |
3 | sY127 | ccaccGGCTCACAAACGAAAAGAAA | ccatcGCTGCAGGCAGTAATAAGGGA | 285 |
3 | sY145 | cgtgagCAACACAAAAACACTCATATACTCG | gccaggTTGAGAATAATTGTATGTTACGGG | 155 |
3 | sY124 | gccagCAGGCAGGACAGCTTAAAAG | cgcaccTACTGTGGCAAAGTTGCTTTC | 121 |
4 | sY134 | gcctgGTCTGCCTCACCATAAAACG | gcctcACCACTGCCAAAACTTTCA | 313 |
4 | sY82 | ggattgATCCTGCCCTTCTGAATCTC | gcgtgCAGTGTCCACTGATGGATGA | 275 |
4 | sY128 | ggtcgGGATGAGACATTTTTGTGGG | gccagcAGCCCAATGTAAACTGGAC | 239 |
4 | sY133 | tccaagATTTCTCTGCCCTTCACCAG | ggctggTGATGATTGCCTAAAGGGAA | 189 |
引物序列中,小写为gDNA非互补加尾序列,大写为gDNA互补序列。a:此对引物为正常内参。每一检测管均包含此引物对 |
按表 1所列的4个多重PCR扩增管,配制反应体系,每管含PCR Buffer,Taq DNA酶,dNTPs,gDNA 模板,各STS扩增引物等;按1.2所述PCR扩增检测设计原理设置扩增反应条件;首先采用等引物浓度扩增 ,再根据各目的条带电泳分析的亮度,对引物浓度及反应条件进行优化调整,以保证凝胶电泳各目的条带亮度基本一致而便于结果判断与分析。
1.5 结果观察及分析按5.0 μL扩增产物+1.0 μL 6×Loading Buffer的比例,将各管扩增产物于3.0%琼脂糖凝胶(含EB )100V电泳45~60 min,紫外凝胶成像仪观察结果,根据各目的条带而分析是否存在缺失及缺失的STS 位点。
1.6 准确性和灵敏度验证用已优化的检测体系,检测18例Y微缺失已知阴性和阳性样本,观察检测结果的符合程度。并应用建立的检测体系,与深圳亚能生物公司生产的Y染色体微缺失试剂盒,平行检测112份临床常规样本,对比分析两种方法的检测结果。
2 结果 2.1 优化确定的多重PCR反应体系优化的4个多重PCR反应体系,总体积25.0 μL,每管均含1×PCR Buffer、0.2 mmol/L dNTPs、2.0 U Taq酶、20~100 ng gDNA、各STS位点上下游引物(各STS的上下游引物量见表 2所列)。优化的 PCR扩增条件为:95 ℃变性5 min;95 ℃45 s→56℃ 60 s→72 ℃ 30 s,3个循环(预扩增);92 ℃ 30 s→68 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃再延伸5 min,15 ℃ Hold。此优化体系,PCR产物凝胶电泳观察,各反应管扩增目的条带的亮度基本一致(图 1A)。
反应管1 | 反应管2 | 反应管3 | 反应管4 | ||||
STS | 引物量 (pmol) | STS | 引物量 (pmol) | STS | 引物量 (pmol) | STS | 引物量 (pmol) |
sY14 | 7.0 | sY14 | 7.0 | sY14 | 7.0 | sY14 | 7.0 |
sY254 | 5.0 | sY84 | 5.0 | sY86 | 4.0 | sY134 | 5.0 |
sY143 | 5.0 | sY239 | 5.0 | sY127 | 7.0 | sY82 | 5.0 |
sY242 | 4.0 | sY152 | 5.0 | sY145 | 4.0 | sY128 | 5.0 |
sY255 | 4.0 | sY124 | 4.0 | sY133 | 5.0 | ||
每管总体积为25 μL;各位点上、下游引物量相同,均为表中所列 |
应用此体系检测18例已知阴性和阳性样本的结果与靶值相符。112例临床常规样本,此体系及对照试剂盒均检出阳性标本15例,且检出的缺失位点范围一致,显示这两种检测方法的符合率为100%。图 1为应用本体系检测的样本中,1个正常样本(图 1A)和3个缺失阳性样本(图 1B、C、D)的凝胶电泳结果。
3 讨论多重PCR体系的优化过程繁琐且基本上取决于经验,一直以来都是科研人员所面临的难题。检测体系中各PCR反应的扩增效率基本一致而保证各目的序列均能有效检出,是多重PCR检测体系成功的关键。然而,影响扩增效率的诸多因素之中,引物结构与浓度、DNA模板的影响尤为明显,所以在体系优化过程中 ,通常先采用相等的引物量,再根据各PCR反应的强弱而调整反应中各引物的比例,即增加“弱”反应的引物量,而减少“强”反应的引物量[7];另外,再采用PCR添加剂、调整反应体系其他组分浓度及反应条件等手段而尽可能减小DNA模板对扩增效率的影响。本研究设计的加尾引物设计策略,引物只在预扩增阶段结合原始gDNA模板进行扩增,后续PCR反应则以预扩增的短片段PCR产物为模板,所以基本消除了长链gDNA模板二级结构对扩增效率的影响。并且短片段DNA模板在PCR扩增的变性步骤中更易于解成单链,稍低的变性温度也保护了Taq酶的活性。另外,预扩增阶段合成的DNA模板两端引入了人工添加的gDNA模板非互补碱基序列,提高了PCR扩增检测步骤中DNA模板的单一性及扩增反应的特异性。据此 ,本策略从引物和模板这2个最关键的因素,减小了多重PCR体系中各PCR反应间扩增效率的差异 ,大大简化了多重PCR体系的优化过程。本研究中,通过最初相同引物量扩增后的电泳结果,对其中亮度不一致的扩增子的引物稍作调整即完成了体系优化。如表 2所示,只有少数位点的引物量有较小差异,说明了本研究设计的加尾引物多重PCR技术策略切实可行、效果明显。
Tiepolo等[8]于1976年即提出了Y染色体无精子因子(AZF)区域的微缺失与男性生精功能障碍和异常密切相关,可导致临床上的无精子症。虽然辅助生殖的胞质内精子注射技术是男性不育症治疗的突破,但也有可能使遗传缺陷传给下一代,导致子代不育,因此Y染色体微缺失检测在男性不育的诊断和研究中具有重要意义[9]。本研究建立的基于加尾引物技术策略的Y染色体AZF区域15个STS位点微缺失检测方法,反应体系中各位点的引物浓度差异不大,并在一定程度上消除了原始gDNA模板对扩增效率的影响,因而体系稳定,操作简单、结果准确,且可根据电泳图谱确定缺失的STS位点,结合本研究提供的引物序列而定位到Y染色体上gDNA序列的具体物理位置及范围,适合Y染色体微缺失的科学研究及临床样本的快速检测。同时,本研究也充分证明了加尾引物多重PCR技术策略的可行性与有效性,可为其他多重PCR检测体系的设计与建立提供参考和借鉴。
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