前列腺癌是泌尿系常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家和地区发病率居首位，死亡率居第2位^[1]；在我国，虽发病率低于西方等国家，但近年来逐渐升高。前列腺癌目前的治疗多为多模式综合治疗，包括手术切除、放疗、内分泌治疗等，由于雄激素抵抗，手术及放疗对于晚期前列腺癌患者疗效不显著。前列腺癌易复发、侵袭和转移，因此积极寻求前列腺癌相关肿瘤标志物成为前列腺癌早期检测、靶向治疗和预防复发的关键^[2]。精子相关抗原9(SPAG9)，是癌睾丸抗原(CTA)家族成员之一，在睾丸组织中特异性表达^[3]。目前主要观点认为，SPAG9主要是作为支架蛋白，辅助活化JNK信号通路，从而促进肿瘤的增殖、侵袭及转移，抑制肿瘤凋亡等。JNK信号通路的活化对于肿瘤的促进均有报道^[4]。由此推测，在肿瘤中，SPAG9表达上调，可改变原有的基因调节模式，促进肿瘤的增殖、侵袭及转移等。本研究主要探讨SPAG9对前列腺癌细胞PC3侵袭、增殖及生长等生物学行为的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂

人前列腺癌细胞PC3为本实验室保存，血清(Gibco，美国)，DMEM培养基(Sigma，美国)，兔抗人单克隆SPAG9抗体、兔抗人多克隆磷酸化ERK抗体、兔抗人多克隆ERK抗体、兔抗人多克隆磷酸化JNK抗体、兔抗人多克隆JNK抗体(CST，美国)，鼠抗人单克隆GAPDH抗体、总蛋白提取试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。TRIzol、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(TaKaRa，中国大连)，SDS PAGE胶试剂盒(碧云天，中国上海)。转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，美国)，M29真核表达载体及M29-SPAG9真核质粒由广州复能基因有限公司提供，SPAG9序列来源于NCBI网站(ID: 9043)。 1.2 细胞培养及病毒转染

人前列腺癌细胞PC3培养于10%的完全培养基，放在5% CO₂、37 ℃孵箱培养，每3天更换培养基，当细胞长至90%融合时进行传代培养。按照5×10⁵接种于6孔培养板，生长至90％融合时，分别以M29-SPAG9与M29转染PC3细胞(质粒均带有绿色荧光及抗性)。转染48 h后，加入G418(300 mg/mL)筛选并建立稳定转染细胞系，荧光显微镜下观察转染效果，PCR及Western blot检测转染效果。 1.3 qRT-PCR检测

用TRIzol提取细胞总RNA，以其为模板，逆转录cDNA，条件是42 ℃，2 min，37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,按照qRT-PCR试剂盒(DRR037A)SYBR Green法步骤进行PCR扩增，qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火45 s，以GAPDH作为内参，扩增40个循环周期，每个标本3个复孔。人SPAG9引物序列为5′-AGTCATCAGCCCACAAAGTAGCAG-3′，5′-GATTCTCCACCTTCATCACCCATT-3′，扩增目的片段大小为173 bp。 1.4 Western blot检测

用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，RCDC法检测蛋白浓度，经5％的浓缩胶和6％的分离胶SDS-PAGE电泳，每孔上样量为80 μg总蛋白。浓缩胶60 V电泳1 h，分离胶100 V电泳1 h，常规湿法转膜120 min，5％的BSA封闭1 h，免疫抗体反应 (稀释比例，一抗 SPAG9 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶500； 二抗：山羊抗鼠1 ∶5 000，山羊抗兔1 ∶5 000)。ECL化学发光，凝胶成像系统显影。 1.5 CCK-8法检测细胞增殖

取处于对数生长期的转染M29-SPAG9和对照组M29细胞消化成单细胞悬液，分别按照4 000个/孔接种于96孔板，每孔加入100 μL完全培养基，设置6个复孔。分别于0、24、48 h加入CCK-8检测试剂，每孔加入10 μL，再次置于孵箱培养2 h检测，于酶标仪上检测450 nm处各孔光密度值[D(450)]。 1.6 流式细胞术检测细胞周期

取处于对数生长期的转染M29-SPAG9和对照组M29细胞消化成单细胞悬液，分别按照5×10⁵接种于6孔培养板，生长至90%融合时，消化成单细胞悬液，胰酶消化，收集各组细胞，预冷PBS清洗2～3次，重悬细胞于EP管中，于流式细胞仪上检测细胞周期情况。按细胞周期检测试剂盒说明进行操作，使用碧云天PI染色试剂盒操作说明。 1.7 Transwell体外迁移实验

PC3细胞接种至24孔板中并分别转染M29和SPAG9，每组设3个复孔。转染24 h后将细胞温和消
化下来，计数并接种至Transwell小室上室(约细胞1×10⁵/孔)，上室为无血清培养基，下室为含10%胎牛血清的培养基。培养24 h后弃掉培养基并用PBS清洗，4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗3遍，0.1%结晶紫染色15 min，棉签轻轻刮掉小室上室内的细胞，显微镜下随机选取10个视野倒置显微镜下观察并计数。 1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，计量数据以 x±s表示，两组间比较采用t检验或非参数秩和检验，两配对样本之间采用配对t检验。 2 结果 2.1 过表达SPAG9人PC3前列腺癌细胞的建立和鉴定

用M29-SPAG9(实验组)及空质粒M29(对照组)转染前列腺癌PC3细胞，48h后分别通过qRT-PCR和Western blot 来检测细胞中SPAG9的mRNA及蛋白水平的变化，结果显示，转染M29-SPAG9组与转染M29组比较，SPAG9表达量显著增高，mRNA表达量实验组(20.776 3±3.080 9)，对照组(1.010 2±0.178 4)，蛋白水平见图 1。证实SPAG9转染前列腺癌细胞PC3构建成功。

1： M29组；2： M29-SPAG9组图 1 转染SPAG9对前列腺癌PC3细胞株中SPAG9蛋白 水平的影响

图选项

采用CCK-8法测定稳定转染前列腺癌细胞PC3的D(450)，M29-SPAG9组CCK-8光密度值明显高于M29组(P<0.05，图 2)，说明过表达SPAG9后促进前列腺癌细胞PC3的增殖。

a：P<0.05，与M29组比较图 2 过表达SPAG9对前列腺癌PC3细胞生长的影响

图选项

采用流式细胞术检测稳定转染后PC3的周期比值，转染M29-SPAG9后，与对照组相比，G₂/S期的细胞比例增加，而G₀/G₁期的细胞比例减少(图 3)，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明过表达SPAG9后促进前列腺癌细胞PC3的细胞周期。

A：M29组流式细胞术检测结果；B：M29-SPAG9组流式细胞术检测结果；C：两组细胞周期分布 a：P<0.05 ，与M29组比较 图 3 过表达SPAG9对PC3细胞周期的影响

图选项

用M29-SPAG9及M29质粒分别转染PC3细胞24 h 后，收集细胞采用Transwell检测PC3细胞穿膜能力。SPAG9组穿膜细胞数为(88.078±4.509)/视野，对照组穿膜细胞数为(54.333±4.582)/视野，SPAG9组细胞转移能力明显高于对照组(P<0.05)，说明过表达SPAG9可明显促进前列腺癌细胞PC3的迁移能力(图 4)。

A： M29组；B： M29-SPAG9组 图 4 过表达SPAG9对PC3细胞迁移能力的影响 (结晶紫 ×200)

图选项

Western blot检测结果显示，转染M29-SPAG9对磷酸化的ERK、JNK都有活化，而总的ERK和JNK没有变化(图 5)，说明转染SPAG9活化了ERK和JNK信号通路，并通过此促进细胞的增殖和细胞周期。

1： M29组；2： M29-SPAG9组 图 5 过表达SPAG9活化了ERK和JNK信号通路

图选项

研究证实，SPAG9在不同的肿瘤中均有增高，且促进肿瘤的侵袭、转移及增殖等生物学行为，如肾癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、甲状腺癌、直肠癌等^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。近年，国外学者发现SPAG9不仅在肿瘤组织表达的阳性率超过80%(蛋白水平和RNA水平)，而且该抗原免疫原性强，能引起肿瘤患者较强的体液免疫反应，产生相应抗体^[11]。SPAG9抗体在卵巢上皮癌患者血清中的阳性检出率为67％ ，并在活体内各种组织类型的早期阶段(Ⅰ～Ⅱ期)表现出高的抗SPAG9免疫活性，而健康人血清中完全没有。

Li等^[12]报道，在前列腺癌148对标本中，免疫组化证实SPAG9阳性表达的占54例，阳性率36.5%，且SPAG9的表达与前列腺癌的分期分级密切相关。SPAG9在前列腺癌中的表达越高，前列腺癌恶性程度高，患者预后越差，这一现象提示我们SPAG9的表达与其侵袭、转移密切相关。因此，本研究采用在前列腺癌中相对SPAG9表达较低的PC3细胞，过表达SPAG9后，细胞穿膜数明显增加，其侵袭能力明显增强。这一想象表明，SPAG9促进前列腺癌的侵袭转移，加快其发生、发展。

既往研究^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}表明，在肾癌、结肠癌、宫颈癌及肺癌中，干扰SPAG9后，细胞增殖减慢。在本实验中，过表达SPAG9后，PC3细胞增殖加快。此外，膀胱癌相关研究^[13]表明，过表达SPAG9后，cyclin D1、B和E表达上调，细胞周期加快，提示过表达SPAG9可促进恶性肿瘤细胞的生长，且这一过程主要是通过调节周期相关蛋白来实现的。而cyclin D1在多种癌中表达上调，其作用主要使细胞从G₁期进入G₂/S期，从而加快细胞周期。本研究中，过表达SPAG9后，G₂/S期细胞比例明显增加，说明在前列腺癌中，SPAG9通过对细胞周期的调控作用，促进其增殖和生长。

但是SPAG9如何促进了前列腺癌细胞的侵袭转移，目前仍不清楚。众所周知，MAPK信号通路与细胞生长的关系最为密切，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等多种进程^[14]。文献^[15]报道，通过氨基端序列分析发现，SPAG9与JNK相互作用蛋白具有结构同源性，通过N端JNK结合域与JNK结合而在MAPK信号通路发挥作用，也就是说，SPAG9在MAKP信号通路中正是作为 一种支架蛋白来起作用，参与人体多种生理功能^[16]。那么在前列腺癌中，是否也是如此？本研究证实，PC3过表达SPAG9后，JNK及ERK信号通路明显活化。而这一实验结果说明SPAG9是通过JNK及ERK信号通路发挥促进肿瘤侵袭转移、增殖的作用。

本研究证实SPAG9不仅促进了前列腺癌侵袭转移及增殖，加快细胞周期，且发挥这一作用主要是通过JNK及ERK信号通路来实现的。因此，在前列腺癌中，SPAG9可能作为一个潜在的肿瘤标志物，有利于肿瘤早期的诊断及治疗，尚需进一步动物实验及临床标本证实 。