蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)具有发病急，致残、致死率高，早期救治困难等特点。对于SAH的研究，近年来有学者提出了SAH后早期脑损伤(early brain injury，EBI)[1-2]的概念，认为发生于SAH后72h内，主要包括全脑缺血、血脑屏障的破坏、脑水肿、免疫炎症和细胞凋亡等一系列的病理变化，对SAH患者的早期病死、病残负主要责任[3,4]。
液态氟碳全氟辛基溴(perfluorooctyl-bromide，PFOB)作为新一代的全氟碳化合物(perfluorocarbon,PFC)，因其独特的不透射线、声学、磁学特性及安全、稳定等特点，被广泛用于超声、CT及MR造影剂的研究[5,6]，同时PFOB具有极强的携氧能力、高度稳定性、良好的扩散性，低表面张力，低黏度，高密度以及高气体溶解度等特点[7,8]，已广泛用于生物医学多个领域，但用于蛛网膜下腔出血方面尚未见报告。海马神经元对缺血缺氧具有高度选择敏感性,短暂性脑缺血缺氧发作即可导致该区域神经元细胞发生凋亡、坏死。所以海马成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区。因此,本实验选取海马组织为研究对象，给予SAH模型大鼠结合了高浓度氧的液态氟碳纳米粒干预，观察PFOB是否能对SAH后海马神经元起到保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验试剂PFOB购自Alliance Pharmaceutical公司，于重庆医科大学超声影像学研究所制成粒径(90.2±8.3)nm乳化纳米粒；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司，DAB显色剂购自DAKO公司。Caspase-3抗体购自Abcam公司，β-actin内参购自上海生工公司。其余试剂由重庆医科大学附属第一医院实验中心提供。
1.2 动物及分组成年健康雄性SD大鼠90只，由重庆医科大学实验动物中心提供，体质量(300±5)g，分为3组，每组30只，分别为假手术组(SHAM)、蛛血组(SAH)及PFOB干预组(SAH+PFOB)。SAH组采用经视交叉前池注血法制作SAH模型，SHAM组同SAH组，但不注射动脉血液；PFOB干预组于造模成功后3 h通过尾 静脉注射溶解高浓度氧的PFOB纳米乳化剂(5 g/kg)。 造模后24 h，4%多聚甲醛心脏灌注取脑，完成海马CA1区透射电镜切片观察，免疫组化检测及TUNEL阳性细胞计数。其中SAH组及SAH+PFOB组又分为12、24、48、72 h 4个时相点，于各时相点提取海马组织，-80 ℃保存，提取蛋白行Western blot检测。
1.3 麻醉使用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，术中使用保温台维持体温，观察呼吸及心率变化。
1.4 PFOB乳化纳米粒制作经过前期工作积累，已经掌握稳定制备PFOB纳米粒方法。PFOB 纳米粒外观为均匀乳液状，室温下静置1 h以上不发生分层现象。能够在4 ℃冰箱中保持稳定状态1个月以上，肉眼与显微镜观察，在此期间其外观和形态均无明显改变。PFOB纳米粒细小而密集，形态规则、呈球形分布，纳米粒间无明显聚现象。PFOB纳米粒径(90.2±8.3)nm，粒径分布窄(图 1)。
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| 图 1 扫描电镜下PFOB纳米粒(A)和PFOB纳米粒粒径分布(B) |
使用经视交叉前池注血法制作SAH模型。大鼠麻醉并固定，额部备皮、消毒额部，正中开颅，牙科钻头颅骨钻孔，采用立体定向仪在前囟前7.5 mm，倾斜矢状面30°进针，10 mm左右达到颅底。股动脉抽取动脉血0.2 mL，自制带侧孔针头缓慢注射，注血时间2 min,注射结束后骨蜡封闭颅骨骨孔。缝合额部、股部切口。术中维持肛温37 ℃。术后护理：麻醉未清醒前给予电热毯保暖，维持室温30 ℃。术后大鼠单笼饲养，注意保暖。假手术组除不注入动脉血外，余操作与SAH 模型大鼠相同。
1.6 脑水含量测定每组各选取5只大鼠，于术后24 h断头取出脑组织迅速称质量(采用干湿质量法)，置烤箱烤干至恒重，计算脑含水量：脑组织含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。
1.7 透射电镜观察4%戊二醛心脏灌注取脑，2.5%戊二醛固定、1%锇酸固定、丙酮梯度脱水、包埋、聚合、修复、切片、染色后透射电镜观察。
1.8 免疫组化取大鼠脑组织石蜡切片，经脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、一抗结合、二抗结合、DAB显色、复染、盐酸酒精分化、返蓝、脱水、中性树胶封片后分析。
1.9 原位细胞凋亡检测技术(TUNEL)取大鼠脑组织石蜡切片，经脱蜡、抗原修复破膜、阻断内源性过氧化物酶活性、DAB显色、复染、盐酸酒精分化、返蓝、脱水、中性树胶封片后照相分析。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，光镜下凋亡细胞呈棕黄色,于高倍镜(×400)下随机观察 10个视野(来自不同切片),计数海马神经元凋亡细胞所占比值的平均数。
1.10 Western blot检测每组随机取5只大鼠。取脑，置于细胞裂解液中，低温匀浆，静置10 min后加入90 μL 100 g/L NP-40，剧烈震荡30 s，4 ℃ 13 000 r/min离心15 min，取上清，分装-80 ℃保存备用。蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液，95 ℃变性5 min。取30 μg样品在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转至硝酸纤维素膜，根据分子量大小切取条带，取相应条带分别加入兔抗Caspase-3多抗(1 ∶250)，4 ℃过夜，TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔IgG抗血清(1 ∶150)室温下震荡孵育1.5 h，TBST洗涤后，与卵白素-辣根过氧化物酶复合物室温下孵育2 h，DAB显色。将特异蛋白条带用扫描仪进行扫描，以β-actin为内参照，应用图像分析系统测定条带灰度值。
1.11 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件处理，采用单因素方差分析和相关分析。检验系数α=0.01。
2 结果 2.1 造模及干预后24 h各组大鼠脑含水量测定SAH较SHAM组脑含水量明显增加[(80.65±0.49) vs (76.32±0.52),P<0.01],SAH+PFOB组较 SAH组比较，脑含水量明显降低[(78.40±0.72) vs (80.65±0.49)，P<0.01]。
2.2 透射电镜观察造模及PFOB干预后24 h，4%戊二醛灌注取脑，海马CA1区制成电镜超薄切片，透射电镜下观察。SAH组可见神经元皱缩、核浓缩深染、胞质深染；染色质边聚、核肿胀；毛细血管周围水肿明显。胶质细胞肿胀，溶解。SAH+PFOB组未见凋亡神经元及上述形态学改变，仅可见轻微神经元内质网扩张及线粒体轻微肿胀。SHAM组形态正常，未见上述改变(图 2)。
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| 图 2 透射电镜观察各组大鼠海马CA1区形态学变化 |
造模及PFOB干预后24 h，4%多聚甲醛灌注取脑，组织切片，400倍光镜观察。SHAM组未见Caspase-3 蛋白表达，SAH组较SHAM组Caspase-3表达增加。SAH+PFOB组Caspase-3蛋白表达较SAH组显著减少 (图 3)。
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| 图 3 免疫组化检测各组大鼠海马CA1区神经元Caspase-3表达 (×400) |
400倍光镜下观察海马CA1区神经元，每组5只。SHAM组见少量TUNEL阳性细胞表达，SAH组TUNEL阳性细胞率明显增加[(43.23±2.67) vs (6.33±0.72),P<0.01]，SAH+PFOB组TUNEL阳性细胞表达较SAH组显著减少[(27.48±1.53) vs (43.23±2.67),P<0.01,图 4]。
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| A: SHAM组；B: SAH组；C: SAH+PFOB组 |
| 图 4 TUNEL染色检测各组大鼠海马CA1区神经元凋亡 (×400) |
分别于造模及药物干预成功后按时间点提取各组大鼠海马蛋白，Western blot检测结果显示，SAH+PFOB组较SAH组Caspase-3蛋白表达在12、24、48、72 h 各时间点均可见明显降低(P<0.01,图 5)。
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| A: Western blot检测结果 1：SHAM组；2~5：SAH组12、24、48、72 h；6~9： SAH+PFOB组12、24、48、72 h；B:半定量分析结果 a:P<0.01,与SAH组各对应时间点比较 |
| 图 5 Western blot检测各组大鼠海马Caspase-3蛋白的表达 |
SAH后72 h内早期脑损伤所引起全脑缺血、脑水肿、氧化应激反应和免疫炎性反应等会导致广泛性的细胞凋亡。而减轻细胞凋亡可在很大程度上减轻早期脑损伤[9]。Caspase-3是细胞凋亡过程中主要的效应因子之一,是由多种凋亡刺激信号传递过程的会聚点,已经作为研究凋亡的常用指标之一[10]。PFOB属于第3代的PFC，相比于1、2代PFOB具有更高的稳定性及携氧能力，粒径更小，分布均匀且不易变性。数据显示常温一个大气压下，每100毫升PFOB最多溶解氧气约66 mL[11]，溶解二氧化碳约166 mL；同样条件下，每100 mL 血液只能溶解氧气约0.3 mL，血红蛋白结合的氧气约18.7 mL，远远超过血液携带的氧气。PFOB中的氧分子不必跨越红细胞膜，这就提高了细胞的浓度梯度，并使氧分子在靶灶处扩散更为容易。前期工作中通过改进微液化技术，成功制备了平均直径90 nm 左右的纳米级液态氟碳乳化剂。此纳米级的PFOB乳化剂微粒排列更接近毛细血管壁，更易通过血管壁及脑组织，也大大缩短了氧分子转运的路程。因此，PFOB纳米粒具有生物体内安全、稳定，极高携氧能力、良好穿透能力以及多模态显像能力，静脉注射快速作用于病灶等优良特性。
本研究表明，PFOB对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的保护作用明显，主要表现在：SAH+PFOB组较之SAH组，脑含水量明显降低，海马CA1区透射电镜观察结果示蛛血后的神经元凋亡、胶质细胞肿胀、毛细血管周围水肿等现象有所减轻。提示PFOB能改善大脑缺血缺氧状况，在细胞及亚细胞层面对神经元起到保护作用。Western blot检测结果显示：促凋亡因子Caspase-3在SAH早期各时间亚组均可见明显降低，同时通过凋亡最明显的SAH后24 h时相点的TUNEL法测凋亡细胞阳性率及免疫组化也可得到相同的结果，说明PFOB在分子层面实现了对神经元的保护作用。这初步说明了在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中，溶解高浓度氧的液态氟碳纳米粒，可以减轻神经元凋亡，保护神经元，在多个层面实现对蛛网膜下腔出血后早起脑损伤的保护。PFOB其发挥作用的具体机制尚不清楚，考虑可能从以下几个方面产生保护作用：氟碳对氧摄取-释放速率极快，颗粒小，氧分子浓度梯度大，能迅速给脑组织提供充足的氧；能迅速带走微循环中高浓度CO2，减轻酸中毒，缓解血管痉挛氟碳粘度低，能稀释红细胞及纤维蛋白原，降低血液粘度，改善脑血流；氟碳本身不含有血液有形成分，能减少氧自由基的产生及释放。
自Clark等[12]开创了PFC作为呼吸气体载体的生物医学研究以来，PFC已经用于血液替代品[13]，液体通气治疗呼吸系统疾病[14]，心血管系统方面的心肌梗死、冠脉成形术，CO中毒急救，靶向药物载体[15]，新型造影剂[16]等多个领域。在神经外科领域，PFC具有增加脑血流，清除自由基[17]、预防出血性梗死、减少出血性脑梗死面积[18],动物脑卒中后的保护作用[19]、颅脑外伤后的意识恢复[20]、脊髓外伤后神经元的保护作用[21]等多个方面作用。但在蛛网膜下腔出血方面的作用还未见相关报道。目前对蛛网膜下腔出血的干预性研究中，主要通过脑室注药、腹腔注射、胃内灌注药物等方式实行干预，因受药物动力学及血脑屏障等的影响，其干预效果不稳定。本实验将氟碳化合物用于蛛网膜下腔出血的研究，通过尾静脉注射PFOB纳米乳化剂，利用其极高的携氧能力、良好的穿透能力、良好的扩散性，低表面张力、低黏度，高密度以及高气体溶解度等独特的物理特性，经血液循环到达目的区域。同时下一步实验中可能利用其多模显像能力在治疗SAH的同时对病情实时监控，应用前景较大。本项目所获实验数据，可推动PFOB纳米粒尽快应用于临床，为进一步治疗蛛网膜下腔出血提供新的思路。
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