516400 广东海丰,广东医学院附属彭湃纪念医院肿瘤科
Parthanatos被Harrza[1]定义为多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)/AIF/核酸内切酶G(EndoG)线粒体凋亡途径,一种新的细胞死亡形式。其机制为凋亡因素刺激下PARP-1由细胞核转位至线粒体,继而线粒体膜孔开放,导致AIF和EndoG由线粒体转位至细胞核,引起细胞核DNA大片段(50 kb)断裂[2]。而且,这种凋亡途径是Caspase非依赖性的,更加直接、迅速[3]。Wang等[4]认为AIF是Parthanatos中的关键分子,AIF的核转位是这种死亡途径的重要特征。AIF定位于线粒体内膜,参与氧化呼吸链的构成,在刺激因素作用下,转位至细胞核,结合与DNA螺旋深沟处,募集EndoG等,使DNA断裂,导致细胞死亡[5]。目前研究发现,多种刺激因素可导致AIF核转位,导致细胞凋亡。医用X线是否也能诱导肺癌细胞AIF核转位,引起核DNA断裂,从而导致细胞凋亡,尚不清楚。本研究首先用IHC法和免疫荧光IF法证实AIF在SPC-A-1细胞中的定位,然后用平板克隆形成法和WST-1法测定X线对细胞的半数致死剂量(LD50)。LD50辐射SPC-A-1细胞,激光共聚焦观察两种细胞AIF由胞浆向胞核转移的形态学变化及核凋亡形态变化。RT-PCR、Western blot技术分析辐射后不同时间AIF基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。最后运用亚细胞组分Western blot技术定量分析AIF由线粒体向细胞核的转位。TUNEL证实辐射后细胞DNA断裂的早期凋亡现象。证实Parthanatos是否在X线辐射后的肺腺癌SPC-A-1中发生,以期为肺癌辐射敏感性调控研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料人肺腺癌细胞系SPC-A-1购自中国医学科学院上海生物细胞研究所。倒置荧光显微镜及照相系统(Leica公司),激光共聚焦显微镜( ReverTra Ace逆转录试剂盒、KOD Plus PCR试剂盒(日本TOYOBO公司),WST-1细胞毒性及细胞增殖检测试剂盒(杭州Beyotime公司),MP-3型小型转膜仪(美国Bio-Rad公司),PCR仪(Techgene公司)。Hoechst33342(美国Sigma公司),标准胎牛血清(天津TBD公司),RPMI1640培养基,辣根酶标记兔抗山羊IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记兔抗山羊IgG(北京中杉金桥公司),山羊抗人AIF抗体、小鼠抗人Actinβ抗体(Santa Cruz公司),DNA maker(200~2 000 bp,杭州博日),Mitotracker red线粒体荧光染色剂(美国Invitrogen公司),亚细胞蛋白组分提取试剂盒、TUNEL法凋亡检测试剂盒(杭州碧云天公司)。
1.2 细胞培养SPC-A-1细胞用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)培养,置入37 ℃、5% CO2孵箱,2~3 d换液1次,细胞长满80%后用0.25%胰酶消化、传代。取对数生长期细胞计数接种,用于后续实验。
1.3 免疫组化及免疫荧光对数生长期的SPC-A-1细胞接种于6孔板内盖玻片上,继续培养12~18 h使细胞贴壁。免疫组化利用Santa Cruz公司山羊抗人AIF多克隆抗体、北京中杉金桥辣根酶标记兔抗山羊IgG标记二抗和DAB显色试剂盒说明进行。4 ℃ 4%多聚甲醛固定20 min,3% H2O2 封闭10 min,37 ℃ 5% BSA封闭30 min,在载玻片上滴加20 μL山羊抗人AIF抗体(1:200),4 ℃孵育过夜,辣根酶标记兔抗山羊IgG稀释度(1:200)37 ℃孵育30 min,DAB显色液显微镜下显色,苏木精复染,用乙醇梯度脱水,中性树胶封皮,Leica显微镜下观察AIF在正常培养细胞中定位情况。
IF使用FITC标记兔抗山羊IgG作为二抗,1% Triton X-100渗透25 min,AIF一抗孵育同免疫组化,FITC标记兔抗山羊IgG稀释度(1:150),37 ℃孵育,Hoechst33342对核复染,Leica显微镜下观察和扫描。 FITC为明亮的黄绿色荧光。Hoechst33342为蓝色荧光。
1.4 细胞辐射本实验使用数字化直线加速器23EX(美国VARIAN公司),射线能量6 MV,剂量率400 cGy/min。细胞放疗时表面以2 cm厚补偿膜辅助剂量建成。
1.5 平板克隆实验对数生长期细胞,配成单细胞悬液,接种于6孔板中,不同剂量组对应接种细胞的数目:对照(200)、1 Gy(200)、2 Gy(200)、4 Gy(200)、6 Gy(400)、8 Gy(600)、10 Gy(600),每组设3个重复孔。接种后培养24 h使细胞贴壁,辐射细胞后继续培养10~14 d,直至出现可见克隆,甲醇固定15 min,1%结晶紫染色30 min。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数,按公式计算接种效率(PE)。PE=(对照组克隆数/对照组接种细胞数)×100%。统计存活率(SF):SF=(实验组克隆数/细胞接种数×PE)×100%;绘制细胞存活曲线,大致推算半数致死剂量LD50。
1.6 WST-1法测定辐射杀伤作用WST-1是MTT的一种升级产品,被线粒体脱氢酶还原生成的formazan是水溶性的,省去了后面的溶解步骤,较MTT更简便且更加稳定,灵敏性更高。对数生长期细胞,制备成单细胞悬液,以每孔2 000个细胞接种于96孔培养板,各组设3个重复孔。继续培养24 h,以1、2、4、6、8、10 Gy辐射细胞,未经辐射细胞作为对照组。放入孵箱继续培养72 h,每孔加入WST-1 20 μL,37 ℃继续培养4 h;放入酶标仪,以450 nm为测定波长,以620 nm为参考波长进行双波长测定光密度值,按公式计算细胞存活率:细胞SF=各剂量组光密度值/对照组光密度值。绘制存活曲线,推算LD50。
1.7 RT-PCR法检测AIF转录对数生长期细胞以LD50辐射,辐射后4、8、12、24 h提取总RNA。收集辐射后细胞,离心后加入1 mL TRIzol充分裂解,200 μL氯仿/异戊醇(24:1),剧烈振荡30 s,台式离心机上12 000 r/min,室温离心5 min;取上清加入等体积的异丙醇,室温下放置5 min;离心后弃上清液,即为总RNA,70%乙醇洗涤后自然干燥,50 μL DEPC-H2O溶解,分光光度器测量,计算产率,并测定纯度。
按试剂盒说明书进行RNA变性及逆转录。AIF引物采用文献[6]已报道序列,上游引物5′-ATGTTA-GGGCTGACACCAGAACAG-3′,下游引物 5′-GTGGGG- CCTCAGTCTTCATG-3′,目的基因长度1 536 bp;GAPDH 上游引物5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′,下游引物 5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′,目的基因长度400 bp。 灭菌蒸馏水33 μL,10×PCR Buffer 5 μL,10 mmol/L dNTP Mixture 5 μL,25 mmol/L MgSO4 3 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,KOD-plus 1 μL,样品CDNA 1 μL,总体系50 μL。AIF 94 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,62 ℃ 30 s,68 ℃ 90 s,30个循环,68 ℃ 2 min,4 ℃保存;GAPDH 94 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,62 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,30个循环,68 ℃ 2 min,4 ℃保存。取5 μL PCR产物,1%琼脂糖凝胶60 V电泳30 min,在凝胶成像仪中摄像并保存。Bio-Rad公司Quantity one凝胶成像仪附带图像分析模块进行图像分析,测定各条带光密度值,结果以积分光密度值(IOD)表示,实验重复3次。
1.8 Western blot检测蛋白表达
对数生长期SPC-A-1细胞,LD50辐射后4、8、12、24 h抽提蛋白。收集细胞加入500 μL RIPA及3~5 μL PMSF,冰上裂解30 min,离心取上清,加入1/4体积5×SDS还原型蛋白上样缓冲液,沸水煮5 min后冻存。用丙烯酰胺和过硫酸铵按不同比例配置分离胶和积层胶。对照组及4、8、12、24 h组每组上样20 μg,垂直电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部。将滤纸、NC膜、凝胶在电转液中浸泡。恒流电转1 h。室温下用5%脱脂奶粉常温封闭2 h,4 ℃一抗孵育大于18 h,AIF及β-actin一抗稀度为1:1 000;用TBST漂洗3次×10 min;二抗工作液浸泡滤膜(二抗稀释度为1:10 000),37 ℃摇床孵育1 h;TBST漂洗3次×10 min;ECL Advance化学发光试剂将膜完全浸透于混合液中1 min;凝胶成像仪中成像并拍照保存结果。同样方法测定IOD并计算AIF蛋白相对含量。
1.9 激光共聚焦观察AIF荧光标记部分同免疫荧光,观察辐射后AIF在细胞中的位置变化。细胞核标记使用Hoechst33342蓝色荧光,观察辐射后细胞核形态变化。线粒体标记用Mtotracker red为红色荧光。激光共聚焦显微镜下分别获取单色荧光照片,并进行融合。
1.10 亚细胞组分Western blot检测蛋白表达按照杭州碧云天公司亚细胞组分提取试剂盒步骤进行。对数生长期细胞以LD50辐射细胞,辐射后4、8、12、24 h提取线粒体蛋白和核蛋白。以未辐射细胞作为对照组。每20毫升细胞压积中加入200 μL预冷Buffer A,剧烈振荡细胞15 s,冰上放置15 min;加入11 μL 冷Buffer B,充分剧烈振荡5 s,4 ℃ 16 000×g离心5 min;上清即为线粒体蛋白;在离心沉淀物中加入100 μL预冷的Buffer C,最大速度振荡15 s,冰上40 min,每隔10 min漩涡振荡15 s,4 ℃ 16 000×g离心10 min,上清即为核蛋白。蛋白电泳、转膜、杂交、发光部分同1.6。核蛋白组分用Histone做内参照,线粒体蛋白组分用COX4做内参照,计算AIF在不同蛋白组分内的相对含量。
1.11 TUNEL法检测细胞凋亡对数生长期细胞铺片,以LD50辐射细胞,继续培养12 h。按照一步法TUNEL凋亡检测试剂盒步骤,用0.1% Triton X-100冰浴孵育,取试剂盒中TdT酶2 μL,荧光标记液48 μL,配置成50 μL TUNEL检测液。37 ℃孵育60 min,荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。DNA断端呈现绿色荧光。
1.12 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件,数据以 ±s表示,采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 AIF在常规培养细胞中定位SPC-A-1细胞在RPMI1640培养基中生长状态稳定,增殖能力旺盛。IHC结果显示细胞质中呈棕色染色,细胞核为苏木精复染呈淡蓝色,提示AIF定位于胞浆中(图 1A)。IF结果显示AIF为FITC二抗标记,呈绿色荧光分布于胞浆中,细胞核以Hoechst33342标记,呈蓝色荧光(图 1B)。
2.2 平板克隆法及WST-1法测定LD50未辐射细胞作为对照组,将各剂量组细胞接种于
6孔板中,培养14 d后肉眼可见克隆形成,随辐射剂量增高,克隆数逐渐减少(图 2A)。有些克隆的细胞数不
足50(图 2A),计数大于50个细胞的克隆(图 2A),并计算细胞存活率。以辐射剂量为横坐标,细胞存活率为纵坐标绘制细胞存活曲线(图 2B)。WST-1法测定各剂量组细胞存活率,以辐射剂量为横坐标,细 胞存活率为纵坐标绘制细胞存活曲线(图 2C)。经两种方法测定推算,X线对SPC-A-1的LD50大致为3 Gy。
3 Gy辐射细胞后4、8、12、24 h RT-PCR产物电泳图(图 3A),对照组为以双蒸水为模板PCR,证实无假阳性,经统计分析AIF转录水平无变化(P>0.05,图 3B)。辐射后不同时间组AIF Western blot电泳图(图 3C),蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,图 3D)。
2.4 激光共聚焦观察AIF转位3 Gy辐射后AIF逐渐由线粒体向细胞核转位,12 h后 观察到线粒体释放AIF至胞浆,而后定位于细胞核,伴随着细胞核的溶解、碎裂。AIF为免疫荧光染色,以FITC为二抗标记,呈绿色荧光。细胞核以Hoechst33342 染色,呈蓝色荧光。线粒体以Mtotracker标记,呈 红色荧光。将这三种染色图像融合,即成为融合图(图 4)。
2.5 亚细胞组分Westen blot检测辐射12 h在细胞核蛋白组分中检测到AIF,24 h逐渐增多(图 5A),统计分析提示12 h AIF在核蛋白组分中含量显著上升(P < 0.05,图 5B)。辐射后12 h后,AIF在线粒体组分含量逐渐减少(图 5C),经统计分析12 h后显著下降(P < 0.05,图 5D)。
2.6 TUNEL检测细胞凋亡细胞核染色发现,3 Gy剂量辐射细胞12 h后,部分细胞核出现固缩、浓集。TUNEL染色发现辐射12 h后,部分细胞核出现绿色荧光染色,证实了随着细胞核的浓集,细胞核DNA断裂这种凋亡早期事件的发生(图 6)。
3 讨论Parthanatos一种新的细胞死亡形式,这种死亡形式不同于坏死、凋亡、程序性坏死和自噬,特征是核DNA断裂成50 kb的片段,而非凋亡产生180~200 bp或其整数倍的DNA片段形成的DNA Ladder。且这种程序性死亡方式更为直接迅速。AIF由线粒体向细胞核的转位是这种死亡机制中的特征,不需要Caspase的参与。1999年,AIF被Susin等[7]首次鉴定和克隆。在正常情况下,AIF定位于线粒体膜间腔,参与能量代谢,在某些刺激因素作用下,AIF从线粒体中释放至胞浆,进入细胞核,通过EndG对DNA切割,导致细胞核溶解、浓缩、碎裂。并且这个过程不能被Caspase抑制剂阻断,因此是Caspase途径外新的凋亡途径,Hazza首次将其命名为Parthanatos。深入研究发现AIF普遍参与多种刺激因素下细胞的凋亡过程。噪声[8]、低剂量X射线[9]、中子和γ射线[10]、顺铂[11]、伊马替尼[12]、黄连素[13]、塞来昔布[14]等均可导致不同的细胞凋亡,且AIF由线粒体向细胞核转位[15]。因此,Parthanatos是普遍存在的细胞死亡形式,AIF是Parthanatos中的关键分子,而AIF的核转位是Parthanatos的重要特征。医用高能X线能否诱导肺腺癌SPC-A-1细胞中的AIF发生核转位,是否激活了Parthanatos,尚少见报道。本研究重点关注Parthanatos中的关键蛋白AIF的核转位现象。在正常培养的SPC-A-1细胞中,AIF定位于细胞质中。测得3 Gy为LD50,以此剂量辐射细胞,发现辐射后不同时间AIF无论在mRNA水平还是蛋白水平均无显著变化。形态学上,发现细胞受到辐射12 h后,AIF由线粒体转位至细胞核,伴随着细胞核的溶解、碎裂。亚细胞组分定量分析同样发现AIF在辐射12 h后AIF在核DNA蛋白组分中显著增多,而在线粒体组分中显著减少。AIF转位至细胞核后,TUNEL法检测到DNA的断裂,证实了Parthanatos的发生。
通过对AIF及其介导的Parthanatos的研究,其重要性逐渐受到重视。Delavallée将Parthanatos总结为Necroptosis(坏死性凋亡),并总结了可以将AIF和AIF介导的坏死性凋亡通路作为治疗靶点的策略[16]。一方面抑制AIF介导的细胞程序性死亡来治疗缺血损伤和退行性变[17],另一方面加强AIF介导的程序性死亡来进行抗肿瘤治疗,已研发新药BZL101对转移性乳腺癌完成了ΙB期临床研究[18]。因此,AIF及其介导的Parthanatos在肺癌辐射敏感性调控或正常肺组织放射性防护方面也颇具研究意义。
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