从生存获益程度和经济成本效价比来看,只有精准的有的放矢的靶向治疗才可能达到事半功倍的治疗效能。卵巢癌是一组具有不同分子亚型的恶性肿瘤,具有多靶点作用[1],找到不同分子亚型的特定靶点才是关键。以组织类型和临床表现模式为基础的二元理论将卵巢癌进行重新分型是最近对卵巢癌认识的突出进展[2]。该二元模式将卵巢癌分为Ⅰ型和Ⅱ型,二者分别具有不同的侵袭和增殖潜能。因此,针对不同类型的卵巢癌合理选择手术及放化疗的时机至关重要。本课题组前期研究发现,Rap1酶激动剂鸟苷酸交换因子(Crk SH3-domain-binding guanine nucleotide-relea-sing factor,C3G)促进Ⅱ型卵巢癌细胞的增殖和转移,但其在Ⅰ型卵巢癌中的作用尚不明确。因此,本研究 旨在通过探讨C3G在低转移潜能的卵巢癌 (Ⅰ型 卵巢癌)中的作用,从而为个体化治疗卵巢癌提供新的依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞与组织标本人卵巢癌细胞株OVCAR3购自广州弗尔博生物科技有限公司。人卵巢 癌组织来自重庆医科大学附属第一医院妇产科2012年 6月至2014年2月手术切除的标本,其中正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤共7例;Ⅱ型卵巢癌43例(中-低分化浆液性腺癌);Ⅰ型卵巢癌6例(透明细胞癌2例,子宫内膜样腺癌4例)。
1.1.2 主要试剂PCXN2-Flag、PCXN2-Flag-C3G PBabe-puro质粒均由日本北海道大学分子细胞病理教研室惠赠并在前期实验中验证[3],质粒提取盒购自Omega Bio-Tek公司,RPMI1640为Sigma公司产品,胎牛血清购自康源生物公司,转染试剂脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司,Western blot试剂盒购自碧云天公司,兔抗C3G单克隆抗体购自Santa Cruz公司,鼠抗β-actin单克隆抗体购自江苏碧云天公司,兔抗MMP-2多克隆抗体购自博士德公司,抗兔MMP-9多克隆抗体购自Abcam公司,Transwell小室购自Millipore公司。
1.2 方法 1.2.1 OVCAR3细胞的培养、质粒转染及稳定株筛选OVCAR3细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,置于含5%CO2,37 ℃的培养箱中培养。用空白试剂、阴性对照质粒及C3G过表达质粒分别转染OVCAR3细胞,嘌呤霉素筛选出稳定株,将细胞分成3组:野生型组(WT)、阴性对照组(NT)、外源性C3G表达组(C3G)。
1.2.2 Western blot检测细胞及卵巢癌组织均用含RIPA的蛋白裂解液提取蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳,PVDF膜电转,BSA封闭液封闭,特异性抗体孵育,ECL显影,Quantity One软件进行条带灰度值分析,即目的条带值与β-actin的比值。
1.2.3 MTT检测细胞增殖率分别取对数期生长的细胞,按1 ×103个/孔种于96孔板中,于5%CO2,37 ℃培养箱中生长,并在0、1、2、3、4、5、6、7 d加入5 mg/mL 的MTT 20 μL/孔,培养4 d后检测570 nm波长处的光密度值[D(570)],并绘制生长曲线。
1.2.4 平板克隆形成实验按每孔200个细胞种于24孔板中,培养14 d,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下计数克隆团(细胞数>50个)。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%,实验重复3次。
1.2.5 细胞迁移和侵袭实验 1.2.5.1 细胞迁移实验取Transwell小室,接种2×105个细胞,上室含400 μL 10%胎牛血清RPMI1640培养基,24孔板下室含600 μL同样培养基,培养箱培养12 h,取出小室,甲醛固定,结晶紫染色,中性树脂封片,显微镜下计数,实验重复3次。
1.2.5.2 细胞侵袭实验与迁移实验类似,预先在Transwell小室内包被Matrigel基质胶40 μL,细胞接种数为1×105个,孵育25 h。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,计量资料用x±s表示,组间均数比较进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 Ⅰ型和Ⅱ型卵巢癌组织中C3G的表达通过Western blot检测,在Ⅱ型卵巢癌、Ⅰ型卵巢癌、良性肿瘤、正常组织中C3G的相对表达量分别为 (0.873 5±0.174 6)、(0.377 6±0.083 1)、(0.351 1± 0.071 3)、(0.336 2±0.0739 2),结果见图 1。与正常组织和良性肿瘤相比,在Ⅱ型卵巢癌组织中C3G表达增加明显(P < 0.05);而在Ⅰ型卵巢癌组织中表达增加不明显(P>0.05);Ⅰ、Ⅱ型卵巢癌组织中C3G表达有明显差异(P < 0.05)。
2.2外源性过表达C3G对卵巢癌细胞OVAR3增殖、凋亡的影响首先对转染并筛选出稳定表达C3G蛋白的OVCAR3细胞株进行Western blot检测结果显示,与野生型和阴性对照组相比,外源性C3G表达组的C3G蛋白表达明显上调(P < 0.05,图 2)。
MTT检测细胞增殖结果显示,与野生型组和阴性对照组比较,外源性C3G表达组的细胞株增殖能力明显降低(P < 0.05,图 3)。平板克隆实验结果显示,与野生型、阴性对照组相比,外源性C3G表达组的克隆形成能力明显降低(P < 0.01,图 4)。流式细胞检测结果显示,与阴性对照组(8.04±0.71)%相比,外源性C3G表达组(17.76±2.39)%的凋亡率增加(P < 0.05,图 5)。
2.3外源性C3G对卵巢癌细胞OVAR3浸润能力的影响细胞迁移实验结果显示,与阴性对照组相比,外源性C3G表达组进入微孔膜内的细胞数较多(P < 0.05)。同样在细胞侵袭实验中,外源表达C3G细胞破坏Matrigel基质胶进入膜内的数目较多(P < 0.05,图 6)。
2.4外源性C3G对卵巢癌细胞OVAR3 MMP表达的影响Western blot检测结果显示,与野生型和阴性对照组相比,外源性C3G表达组的MMP-2、MMP-9蛋白表达上调(图 7)。由此提示,在OVCAR3细胞株中上调C3G蛋白的表达,能够促进细胞的迁移和侵袭能力,可能与MMP-2、MMP-9蛋白的分泌增加有关。
3 讨论卵巢癌研究进展最突出的表现是在以二元模式对上皮性卵巢癌依据重新进行分型,即依据组织学类型和临床恶性行为将卵巢癌分为Ⅰ型卵巢癌和Ⅱ型卵巢癌。相对以低分化浆乳癌为代表的Ⅱ型卵巢癌,Ⅰ型卵巢癌常可较早被诊断,惰性进展,但化疗相对不敏感[2, 4],临床上Ⅰ型卵巢癌由于化疗抵抗进而复发转移导致治疗失败并非少见。因此,明确调控Ⅰ型和Ⅱ型卵巢癌不同进展的机制,实现个体化治疗,是未来卵巢恶性肿瘤治疗的新方向。
C3G蛋白能够通过细胞外信号的调节参与多种细胞功能[5, 6]。如调节肌动蛋白微丝骨架的重塑;通过Ras-MAPK通路促进血液细胞增殖;通过激活Hck蛋白能够促进多种细胞凋亡;通过整合素信号通路活化Rap-GTP,促进多种肿瘤细胞粘附、迁移[7, 8, 9]。我们曾对同为接头蛋白Crk的下游信号蛋白的C3G/Rap1及Dock180/Rac1的组织细胞内表达及分布进行比较,推测C3G/Rap1在卵巢癌中具有抑癌基因功能[10],但预实验结果显示其在Ⅱ型卵巢癌细胞SKOV3及HEY中有促增殖、促侵袭功能[11]。本研究旨在通过检测C3G在Ⅰ型和Ⅱ型卵巢癌组织是否具有区别表达,以及外源强制表达对低转移潜能的Ⅰ型卵巢癌细胞株OVCAR3恶性增殖和侵袭潜能的影响,反向验证C3G的功能。
本研究表明,C3G蛋白在Ⅰ型和Ⅱ型卵巢癌中表达差异明显。由于Ⅰ型卵巢癌进展缓慢,呈惰性,即由良性的囊腺瘤逐渐发展为不典型增生或交界性肿瘤,直至最终发展为侵袭性肿瘤[12]。相反Ⅱ型卵巢癌由于基因不稳定,常伴有TP53突变、甲基化或BRCA基因的功能失活,具有更强的侵袭性[2]。本研究发现与正常及良性肿瘤表达类似,Ⅰ型卵巢癌中C3G呈低表达状态,提示与临床观察到的Ⅰ型卵巢癌的低度侵袭潜能可能存在相关性。因此,在接下来的研究中将通过与临床分期、分型以及患者疗效及预后的分析,探讨C3G能否作为预测卵巢癌预后的一项指标。
为了明确其在Ⅰ型卵巢癌中的作用,本研究通过筛选具有低恶性潜能的粘液性腺癌细胞株OVCAR3[13, 14],质粒外源性增加C3G在其中的表达,发现C3G表达可引起细胞增殖、克隆形成均出现明显下降,细胞凋亡也明显增加。Dayma等[15]发现,C3G蛋白能够促进β-catenin降解,使其在胞核内聚集减少,负性调节Wnt/β-catenin通路,参与抑制肿瘤细胞增殖。因此,在Ⅰ型卵巢癌中,C3G蛋白的低表达可能使Wnt通路激活而引起肿瘤细胞增殖活性增加。
MMP是一类通过降解细胞外基质,参与肿瘤细胞浸润、转移的蛋白水解酶[16]。其中MMP-2、MMP-9是该家族中极其重要的成员,在卵巢恶性肿瘤进展中,能通过重塑肿瘤微环境,促进癌细胞向周围组织粘附、侵袭以及转移[17]。Guvakova等[18]发现通过IGF-IR-C3G通路中激活Rap1能够促进上皮细胞运动。Liu等[19]的研究中发现MMP的分泌主要是通过Ras-MEK1通路激活,而C3G-JNK通路在这个过程中并无影响。而我们最近的研究发现,在浆液性卵巢癌中通过C3G/Rap1通路,激活Rap1活性,促进MMP-2、MMP-9的分泌,增强细胞的浸润能力[20]。本实验结果显示,外源性表达C3G后,MMP-2、MMP-9的表达升高,并且在细胞表型实验中也发现其迁移和浸润能力增强。这表明Ⅰ型卵巢癌的低转移潜能可能是由于C3G蛋白的低表达减少了MMP-2和MMP-9的分泌而抑制侵袭和迁移的结果。
因此,我们推测在Ⅰ型卵巢癌中,C3G表达降低减弱了对β-catenin的降解,进而激活Wnt/β-catenin通路,促进肿瘤细胞的增殖;同时,C3G的降低减少了MMP-2和MMP-9的分泌,抑制了肿瘤细胞的转移。这与临床所观察到的现象是吻合的,即Ⅰ型卵巢癌在被诊断时常常呈现出生长巨大的肿瘤包块,而极少转移的现象[21]。结合在Ⅱ型卵巢癌细胞中的发现,即C3G对高级别浆液性卵巢癌恶性侵袭性行为的促进作用,我们预测基于癌基因C3G的靶向治疗可能会有利于肿瘤浸润能力的逆转,但必须联合手术才能达到清除肿瘤的目的。不过C3G过表达对低度恶性潜能的卵巢癌细胞的增殖抑制作用原因还不完全清楚,是否提示Ⅰ型卵巢癌中的肿瘤生长可能有其他因素调控,尚需进一步探讨。
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