树突状细胞(dendritic cells，DCs)属于机体内的抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)[1]，能够摄取和处理抗原，能够向幼稚的T淋巴细胞呈递肿瘤抗原，刺激抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞增殖(CTLs),引发针对肿瘤细胞的特异性免疫应答[2]。DCs为临床肿瘤治疗提供了新的希望，研究者在体外研制出DCs肿瘤疫苗，并将其自体回输给肿瘤患者，这些DCs肿瘤疫苗能够诱导针对肿瘤的特异性免疫应答[3, 4]。然而DCs肿瘤疫苗的临床应用效率还需进一步提高[4, 5]。研究表明肿瘤细胞可以通过多种不同的方式逃脱机体免疫系统的监视和攻击，并且肿瘤宿主体内的DCs发生了功能紊乱[6]。我们以前的研究发现，肿瘤来源的因素可以通过改变DCs的细胞骨架蛋白表达，紊乱DCs细胞骨架结构，改变DCs细胞的生物物理特性，从而减低DCs运动能力进而抑制其免疫功能[7, 8]。
曾柱等[9]研究发现肝癌细胞通过抑制DCs的线粒体功能阻止其免疫功能的发挥，曾柱等[10]还发现肝癌细胞微环境会影响DCs的能量代谢状态。由于不同的肿瘤损伤DCs功能的机制是不同的[9]，并且不同分化阶段的DCs执行着不同的免疫功能。肝癌属于实体肿瘤，而对于非实体肿瘤如血液肿瘤对DCs的线粒体功能和能量状态有怎样的影响，它们与DCs免疫功能的正常发挥有着怎样的联系。 为了探讨这一问题，本研究选用血液肿瘤K562细胞与不同分化阶段的DCs共培养48 h，利用流式细胞术、MTT和傅立叶变换红外光谱等方法检测各组DCs的线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度、线粒体酶活力和细胞能量代谢状态的变化情况，为进一步研究血液肿瘤细胞的免疫逃逸机制和提高临床血液肿瘤的治疗效率提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
淋巴细胞分离液(Ficoll 1.077 g/mL)购买于上海试剂二厂；培养基RPMI1640购买于美国Gibco公司，于美国HyClone公司购买培养基成分胎牛血清(FCS)，于美国R&D公司购买实验所需各种细胞因子如重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage CSF,rhGM-CSF)、重组人白介素-4(recombinant human interleukins，rhIL-4)和重组人肿瘤坏死因子-α(recombinant human tumor necrosis factor-α,rhTNF-α)；于美国Sigma公司购买抗人CD14单克隆抗体(FITC标记)、罗丹明123和四唑蓝；人单核细胞阴性选择免疫磁珠试剂盒(monocyte isolation cocktail kit)购买于德国Mitenyi公司； Fluo-3/AM酯购买于美国Molecular Probe公司；Transwell双层培养皿(0.4 μm孔径)购买于美国Corning公司。
1.2 细胞株 K562的培养K562细胞株是人慢性髓性白血病细胞株,由本实验室冻存。2×105/mL的 K562细胞经PBS漂洗后，放入含10%胎牛血清的RPMI培养基的培养瓶中，将培养瓶置于37 ℃，含5%CO2和95%湿度的培养箱中培养。每隔3 d进行1次常规传代，当K562细胞处于对数生长期时收集备用。
1.3 获取不同分化阶段的DCs按曾柱等[9]的方法获得DCs。从健康人外周血中用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，将获得的单个核细胞进行贴壁后进一步分离出单核细胞，利用人单核细胞阴性选择免疫磁珠试剂盒通过含抗CD3、CD7、CD19等鸡尾酒抗体的免疫磁珠(miltenyibiotec)阳性选择除去T细胞、B细胞、NK细胞等非单核细胞，进一步分离纯化出大约95%纯度的CD14+单核细胞。收集这些CD14+单核细胞，放入含100 ng/mL rhGM-CSF和rhIL-4的1640完全培养基中培养7 d，获得未成熟DCs(imDCs)，收集imDCs后再加入20 ng/mL rhTNF-α继续培养3 d获得成熟的DCs(mDCs)。通过流式分析获得的DCs上鼠抗人抗体CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR等抗体表达量对DCs表型进行鉴定，通过台盼蓝染色检测DCs细胞存活率。
1.4 不同分化阶段DCs与K562细胞在Transwell中共培养分别将2×107imDCs或mDCs与2×106 K562细胞在Transwell双层培养皿中共培养48 h(DCs一侧不加任何细胞因子)。Transwell的上室中置入DCs，将这些与K562共培养的DCs命名为DCK组,包括IMK(与K562共培养的imDCs)和MK(与K562共培养的mDCs)。对照组包括正常培养的DCs(包括imDCs和mDCs)，命名为DC组(包括IMDC和MDC)；以及撤细胞因子后继续培养48 h的DCs(包括imDCs和mDCs)，命名为DCC组(包括IMC和MC)。正常培养基中含RPMI1640、10%FBS、100 ng/mL的rhGM-CSF、100 ng/mL的rhIL-4和20 ng/mL rhTNF-α。撤生长因子的培养基含10% FBS、不含rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α的RPMI1640。利用台盼蓝染色检测各组细胞存活率。
1.5 利用流式细胞技术检测各组细胞线粒体膜电位在室温条件下收集各组细胞，用PBS漂洗后制成含1×106个细胞的细胞悬液，在细胞悬液中加入终浓度为5 μg/mL的罗丹明123，再置于37 ℃水浴中孵育30 min，孵育后用PBS将细胞漂洗3次以去除未结合的染料；用500 μL PBS重悬细胞后过细胞筛(300目)使其成为单细胞悬液，利用流式细胞分析仪检测分析各组细胞罗丹明123的表达情况[9]。
1.6 利用MTT法检测各组细胞线粒体酶活力按曾柱等[9]的方法。在室温条件下收集各组细胞，用PBS漂洗后制成含1×106个细胞的细胞悬 液，在细胞悬液中加入终浓度为5 mg/mL的MTT，于37 ℃水浴中避光孵育4 h，将标记后的细胞悬液离心后用PBS漂洗后用PBS重悬，将0.5 mL酸性异丙醇加入每个样本中，吹打混匀，离心后每个样本取0.3 mL上清液加入96孔板，每个样品设置3个复孔，Bio-Rad酶标仪测定各孔光密度值 [D(570)],此光密度值[D(570)]就代表线粒体的酶活力。
1.7 利用流式细胞技术检测各组细胞的细胞内钙离子浓度按曾柱等[9]的方法。在室温条件下收集各组细
胞，用PBS漂洗后收集2×106个细胞，用100 μL PBS重悬细胞，加入Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM酯(终浓度为10 μmol/L)，置于37 ℃水浴中孵育40 min，轻轻震荡数次。将各组未加Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM酯的样品作为阴性对照。PBS漂洗3次后用300 μL PBS重悬细胞，过细胞筛(300目)使细胞成为单细胞悬液，用流式细胞分析仪检测，用CellQuest程序进行数据分析。每组样品和其阴性对照的平均荧光强度差值就是各组细胞内Ca2+浓度，每个样品收集相同个数的细胞，每组细胞进行3次重复测量。
在室温条件下收集各组细胞约2×106个，用含0.9%NaCl的重水洗2次(1 000 r/min，5 min)，弃上清，将离心管底部的细胞悬液(5 μL)用微量移液器转移到CaF2窗片上，在37℃下，放置约10min，直至细胞悬液中大部分的水分蒸发，在窗片上形成潮湿的直径2～3 mm的膜时，再盖上另一个CaF2窗片，固定。将样品上机(NEXUS-470 FT-IR，德国Nicolet公司)测量，每组样品测量3次，得到3组红外吸收谱。以含0.9% NaCl的重水的红外吸收谱作为空白对照谱。采用OMNIC 6.0软件对各组样品的数据进行分析处理。将所有样本的红外吸收谱与重水的吸收谱作差减，再进行傅立叶变换自去卷积。在去卷积谱上，选取2个最低的峰谷作为基线，测量每个峰的高度，即为样品在该峰位的吸收度[10]。
1.9 统计学分析实验数据以
表示，采用SPSS 19.0软件做方差分析，组间采用t检验进行各组数据两两比较。
与对照组相比，包括IMK和MK组的线粒体膜电位明显下降(P＜0.05，表 1)。
)| 组别 | 线粒体膜电位 | 线粒体酶活力 | 钙离子浓度 | 红外光谱吸收强度 | |
| A1030/A1080 | A1030/A2924 | ||||
| IMDC组 | 473.26±22.16a | 0.552 8±0.003 4a | 425.08±18.67a | 0.475±0.003a | 0.327±0.005a |
| IMC组 | 470.18±23.12a | 0.541 3±0.002 8a | 434.29±17.54a | 0.438±0.005a | 0.348±0.003a |
| IMK组 | 403.16±24.68 | 0.362 7±0.002 4 | 564.73±19.32 | 0.236±0.007 | 0.295±0.003 |
| MDC组 | 318.95±18.67b | 0.510 4±0.003 2b | 233.77±12.36b | 0.657±0.051b | 0.289±0.053b |
| MC组 | 320.49±20.35b | 0.506 7±0.003 0b | 230.97±13.02b | 0.667±0.008b | 0.292±0.001b |
| MK组 | 238.46±22.34 | 0.150 0±0.002 6 | 472.97±14.37 | 0.532±0.008 | 0.155±0.003 |
| a: P＜0.05, 与IMK组比较；b: P＜0.05, 与MK组比较 | |||||
IMK的D(570)值低于IMDC和IMC(P＜0.05)，MK的 D(570)值显著低于MDC和MC(P＜0.01，表 1)。
2.3 各组DCs细胞内钙离子浓度与对照组相比，IMK和MK细胞内钙离子浓度增加明显(P＜0.01，表 1)。
2.4 各组DCs的傅立叶变换红外光谱吸收强度与对照组相比，IMK和MK组的A1030/A1080和A1030/A2924明显降低(P＜0.01，表 1)。
3 讨论DCs在机体内能够摄取和处理各种抗原，与机体的免疫应答或免疫耐受密切相关。目前体外诱导DCs主要是通过提取健康人外周血CD14+单核细胞来诱导实现的。科学家在功能上将DCs分为imDCs和mDCs。ImDCs主要位于外周组织，具有很强的抗原摄取和处理功能，mDCs能够在淋巴结内向幼稚的T淋巴细胞进行抗原呈递，并刺激幼稚T淋巴细胞特异性活化和增殖等，参与机体的免疫应答或免疫耐受，可见其与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关，近年来的研究发现肿瘤患者体内的DCs免疫功能缺陷[6]，因而无法诱导针对这些肿瘤细胞的特异性免疫应答，从而导致肿瘤的发生和发展。
线粒体是细胞内重要的细胞器，含有双层膜结构，与细胞的能量代谢密切相关，它还与细胞凋亡、运动、信号转导等关系密切[13]。目前衡量线粒体功能的主要指标是线粒体膜电位和线粒体酶活力。一般情况下，细胞线粒体通过细胞代谢中的三羧酸循环过程形成内外膜的跨膜电位差，即线粒体的膜电位。线粒体的膜电位与线粒体内ATP的合成密切相关，同时反映线粒体膜的完整性。罗丹明123是一种可透过细胞膜的阳离子亲脂性荧光染料，可作为线粒体跨膜电位的指示剂，在细胞发生代谢等异常变化时，线粒体膜的完整性被破坏，罗丹明123被重新从线粒体中释放出来,发出较强的黄绿色荧光，可通过流式细胞等技术检测，其荧光强度可表示线粒体跨膜电位的高低，可反映细胞的代谢和能量状态。线粒体酶活力也是反映线粒体功能变化的重要指标，线粒体酶参与机体三羧酸循环代谢和氧化磷酸化等能量代谢过程，能够反映线粒体内膜损伤程度和ATP的合成量。MTT测量线粒体酶活力的原理是，橙黄色的MTT可以被线粒体脱氢酶NADH和NADPH还原为紫色甲臢(Formazan)，其产量与线粒体酶活力成正比。线粒体酶活力高，线粒体的功能强。研究表明与K562细胞共培养48 h后，IMK组和MK组的线粒体膜电位和酶活力均显著下降，说明K562来源的因素使IMK组和MK组的线粒体功能受到损伤，因此影响IMK组和MK组细胞内能量代谢和氧化磷酸化过程，进而影响IMK组和MK组细胞内ATP的合成，从而使细胞处于低能量状态。有研究发现细胞骨架及其某些结合蛋白能够控制线粒体外膜对ADP的渗透能力，因而能够控制线粒体的呼吸功能进而控制其能量状态[14]，而且细胞骨架状态与细胞在机体内的迁移能力密切相关。有研究发现，线粒体的结构状态与细胞在机体内的迁移能力关系密切[15]。本课题组前期研究发现，K562细胞来源的某些因素损伤了DCs的运动迁移能力[8]，结合本研究结果，说明IMK组和MK组的线粒体功能状态降低可能与其迁移能力受到损伤关系密切，而迁移能力降低势必影响IMK组的抗原摄取功能和MK组刺激T淋巴细胞增殖活化的功能。本研究结果与曾柱等[9]关于肝癌细胞对DCs线粒体功能的抑制作用的结果相似，说明作为非实体肿瘤的血液肿瘤细胞与实体肿瘤肝癌细胞都能够通过降低DCs的线粒体功能状态来损伤其运动迁移能力进而损伤其免疫功能。
本研究还发现与对照相比IMK和MK组细胞内钙离子浓度显著增加。钙离子是细胞内的第二信使，参与细胞的许多生物学行为，钙离子浓度的增加会破坏细胞骨架的稳定性，导致细胞变形能力减低，进而引起细胞迁移能力减低。研究发现线粒体功能与细胞钙离子浓度存在偶联[16]，共培养后IMK和MK组线粒体功能损伤和钙离子浓度增加可能是K562来源因素引起IMK和MK组运动迁移能力受损的部分原因。
红外光谱技术主要是通过不同峰位的波数对应的谱线来阐述各种结构基团的振动情况，以及通过对峰位所处的波数及其强度的影响来了解由于各种结构基团相互作用或环境条件的改变引起的大分子本身的结构或构象变化。近年来研究者应用傅立叶变换红外光谱技术开展肿瘤细胞特性等研究[17]。吸收度比A1030/A1080对应葡萄糖/磷酸盐，代表细胞代谢更新状态，A1030/A2924对应葡萄糖/磷脂，代表细胞消耗自由葡萄糖以进行磷脂重新合成的状态，在共培养后，IMK和MK组A1030/A2924和A1030/A1080比值明显降低(P＜0.01)，原因可能是血液肿瘤细胞K562快速生长过度消耗培养基内的养分，使IMK和MK组可以利用的细胞内自由葡萄糖的含量缺乏，引起IMK和MK组能量代谢低下，这与我们前面发现细胞线粒体功能受到抑制是一致的，本研究结果与曾柱等[10]的研究结果一致，说明血液肿瘤细胞和肝癌细胞一样都能够损伤DCs的能量代谢状态。
总之，本研究结果说明共培养后K562能够引起DCs线粒体功能降低和细胞能量代谢减慢，但其具体作用机制还需我们进一步探讨，共培养后DCs线粒体功能降低和细胞能量代谢减慢可能是血液肿瘤微环境下DCs细胞骨架损伤，迁移能力下降和免疫功能受损的部分原因，本研究将为临床改善DCs肿瘤疫苗应用提供部分理论支持。
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