2. 401331 重庆,重庆医科大学附属大学城医院消化神经中心;
3. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院泌尿外科;
4. 100034 北京,北京大学第一医院泌尿外科,北京大学泌尿外科研究所
2. Center of Gastroenterology and Neurology, University-Town Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401331;
3. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
4. Department of Urology, the First Hospital of Peking University, Institute of Urology Surgery of Peking University, Beijing, 100034, China
肾癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统中致死率最高的恶性肿瘤,肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)为其主要类型。每年全世界大约有102 000例患者因肾癌死亡,发病率和病死率占全部肿瘤的2%~3%,其分子特性复杂,发生机制迄今不甚清楚[1, 2, 3]。RCC诊断主要依靠形态学和影像学,大部分患者就诊时已经是肿瘤晚期,发展成转移性肾癌(matastatic RCC,mRCC),由于RCC对化疗抵抗,所以mRCC患者病死率高。有研究指出舒尼替尼、索拉菲尼等药物对mRCC疗效较好,能提高患者的生存率,但只对部分患者有效[4, 5],RCC主要还是依靠外科手术治疗,晚期治疗非常局限[6]。RCC与大多数恶性肿瘤一样,其发生、发展大多与抑癌基因失活有关,因此通过慢病毒介导抑癌基因的表达是常用的肾癌治疗方法之一。
大肿瘤抑制基因-1(large tumor suppressor gene 1,LATS1)最早采用基因嵌合体筛选法(genetic mosaics)从黑腹菌属果蝇中发现,编码保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,是Dbf2相关核蛋白(nuclear Dbf-2-related,NDR)激酶家族成员[7]。LATS1位于染色体6q24-25,开放阅读框架约3 393 bp大小,编码1 130个氨基酸,相对分子质量大小约126.87×103,与LATS2在结构和功能上高度相似,是Hippo-YAP信号通路中关键因子之一[8]。研究发现抑癌基因LATS1在星形细胞瘤[9]、乳腺癌[10]、头颈部鳞状细胞癌[11]、结直肠癌[12]、宫颈癌[13]、胃癌[14, 15]、皮肤癌[16]、转移性前列腺癌[17]等多种肿瘤中表达降低。Hao等[18]在人正常乳腺上皮细胞系MCF10A中过表达LATS1可降低下游癌基因Yes-相关 蛋白(Yes-associated protein,YAP)诱导的上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、软琼脂糖克隆形成、细胞迁移和锚地性生长等,证实LATS1能抑制肿瘤发生。本研究将通过慢病毒过表达方式在肾癌细胞系786-0细胞中上调LATS1表达,探讨其对肾癌细胞生物学功能及下游癌基因YAP的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞系及主要试剂人肾癌细胞系786-0购自ATCC,RPMI1640培养基、胎牛血清均购自Gibco公司,LATS1过表达慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建,胰蛋白酶购自Sigma公司,总RNA提取试剂RNAiso、逆转录 试剂盒及Taq酶购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司,兔抗人LATS1、YAP抗体购自Santa Cruz公司,兔抗人β-actin抗体、HRP标记羊抗兔IgG、RIPA蛋白裂解液等试剂均购自上海碧云天公司,细胞增殖/毒性试剂 (cell counting kit-8,CCK-8)试剂购自广州奕源生物公司。
1.2 细胞培养786-0细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,在5%CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养。
1.3 过表达LATS1慢病毒载体感染786-0细胞培养786-0细胞,待处于对数生长期时,以每孔2×104细胞数接种6孔板,实验分为3组: 对照组(control group);空病毒组(mock virus group);LATS1感染组(lentiviral-LATS1 group)。置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。24 h后,弃掉培养液,每孔加新鲜培养液1 mL,病毒稀释后以感染复数(multiplicity of infection,MOI)值60的病毒数量加入培养孔中,继续培养12 h后弃去培养液,换新鲜培养液继续培养,每天常规换液,培养96 h,正置荧光显微镜下观察荧光表达情况,感染效率大于80%认为感染成功,转至培养瓶继续培养。
1.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)用RNAiso Plus按RNA提取试剂盒说明书提取对照组、空病毒组、LATS1感染组细胞总RNA,用UV分光光度计检测RNA浓度后,将各组RNA浓度调成一致,并取1 μg RNA模板,按逆转录试剂盒反转录RNA为cDNA,反应体系10 μL,37 ℃孵育15 min,85 ℃加热30 s。PCR扩增基因,LATS1上游:5′-CCACCC-TACCCAAAACATCTG-3′,下游:5′-CGCTGCTGATGA-GATTTGAGTAC-3′,产物长度302 bp;YAP上游: 5′-TGAACAAACGTCCAGCAAGATAC-3′,下游5′-CAGC- CCCCAAAATGAACAGTAG-3′,产物长度165 bp;GAPDH 上游:5′-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3′,下游 5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3′,产物长度528 bp,引物均由TaKaRa大连宝生物工程有限公司合成,扩增条件为95 ℃ 5 min,之后95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环,最后72 ℃ 5 min。RT-PCR产物经 3%琼脂糖凝胶电泳,以LATS1或YAP与GAPDH条带密度比值表示LATS1或YAP mRNA的相对表达水平。
1.5 Western blot检测LATS1和YAP蛋白表达用RIPA裂解液加1%PMSF分别提取对照组、空病毒组、LATS1感染组的细胞总蛋白,BCA测定上清液蛋白浓度。加上1/4体积的蛋白上样缓冲液loading buffer,100 ℃变性10 min。配制SDS-聚丙烯酰胺分离胶和积层胶,加Tris甘氨酸电泳缓冲液,每孔加等量变性蛋白约50 μg,SDS-PAGE电泳后转于PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h。加入一抗(抗LATS1 1 ∶150,抗 YAP 1 ∶200,抗β-actin 1 ∶500)4 ℃过夜,TBST洗膜,3次/ 10 min,再加入辣根过氧化酶标记二抗(1 ∶5 000),37 ℃ 2 h,TBST洗膜,3次/10 min,ECL显影,暗室下凝胶成像仪曝光,以LATS1或YAP与β-actin条带密度比值表示LATS1或YAP蛋白相对表达水平。
1.6 流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测凋亡及其周期取对数生长期786-0细胞经0.25%胰酶消化后,重新接种于培养瓶(细胞密度4×104/mL),分为对照组、空病毒组、LATS1感染组,感染96 h后消化细胞并调整细胞密度为1×106/mL。PBS冲洗2次,离心后加入1 mL PBS吹打均匀,分别加入Annexin-V和PI,室温避光孵育15 min,测定各组细胞凋亡率。按前述方法将细胞离心后,加入1 mL 70%预冷无水乙醇,4 ℃固定过夜,PBS清洗后在浓度为1% RNase水浴10 min,加入碘化丙啶(PI)室温避光染色30 min,3 000 r/min 8 min,以生理盐水重悬后,检测各组细胞周期。
1.7 CCK-8检测增殖将生长良好的786-0细胞接种于96孔平底培养板,每孔100 μL培养液种植2×103个细胞,分为对照组、空病毒组、LATS1感染组。每24、48、72、96、120 小时,加入CCK-8溶液10 μL,继续孵育2 h。用酶标仪在450 nm波长处测定光密度值[D(450)],并计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR):IR=[1-实验组D(450)/对照组D(450)]×100%。
1.8 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件,实验数据为计量资料,用x±s表示,两两组之间比较采用独立样本t检验,多组间单因素分析采用单因素方差分析。检验水准α=0.05(双侧)。
2 结果 2.1 慢病毒感染LATS1后检测786-0细胞感染率慢病毒载体介导LATS1在MOI为60的病毒数量下感染肾癌786-0细胞96 h后,用FCM检测感染效率,结果显示:对照组为0.09%,空病毒组为96.36%,LATS1感染组为83.27%(图 1),说明慢病毒感染成功。
2.2 慢病毒感染获得稳定过表达LATS1的786-0细胞系慢病毒介导LATS1感染786-0细胞96 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况,空病毒组可见大量的绿色荧光蛋白表达,细胞生长良好;LATS1感染组细胞绿色荧光蛋白相对较少(图 2),转入培养瓶中持续培养,建立稳定细胞系。
2.3 RT-PCR检测细胞感染前后LATS1和YAP mRNA表达情况琼脂糖凝胶电泳结果显示,LATS1感染组中LATS1 mRNA表达灰度比(0.76±0.03)明显高于对照组灰度比(0.43±0.02)及空病毒组灰度比(0.44±0.01)(P<0.05),YAP mRNA的表达灰度比(0.41±0.02)明显低于对照组灰度比(0.69±0.01)及空病毒组灰度比(0.70±0.03)(P<0.05),而空病毒组与对照组LATS1和YAP mRNA表达水平无明显差异(P>0.05,图 3),表明慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后上调LATS1 mRNA表达,抑制YAP mRNA表达。
2.4 Western blot检测细胞感染前后LATS1和YAP蛋白表达情况Western blot检测结果显示,LATS1感染组中LATS1蛋白表达灰度比(0.62±0.01)明显高于对照组灰度比(0.27±0.01)及空病毒组灰度比(0.26±0.01)(P<0.05),YAP蛋白表达灰度比(0.29± 0.02)显著低于对照组灰度比(0.74±0.03)及空病毒组灰度比(0.73±0.02)(P<0.05),而空病毒组与对照组LATS1和YAP蛋白表达水平无明显差异(P>0.05,图 4),表明慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后恢复了LATS1蛋白表达水平并下调YAP蛋白表达。
2.5 慢病毒介导LATS1过表达对786-0细胞凋亡及周期的影响LATS1感染组细胞凋亡率(25.69±1.13)%显著高于其对照组(7.49±1.21)%和空病毒组(7.58±1.62)(P<0.05),而空病毒组与其对照组凋亡率相比无明显差异(P>0.05,图 5)。FCM检测结果显示,慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后能诱导细胞凋亡。
LATS1感染组细胞周期停滞于G1期比例(80.69± 2.53)%显著高于其对照组(59.90±1.13)%和空病毒组(60.21±0.97)%(P<0.05),而空病毒组细胞周期停滞于G1期比例与其对照组相比无明显差异(P>0.05,图 6)。FCM检测结果显示,慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后能阻滞细胞周期于G1期。
2.6 慢病毒介导LATS1过表达对786-0细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示,在慢病毒感染前3 d,对照组、空病毒组、LATS1感染组的D(450)无明显差异 (P<0.05),但从第4天开始,LATS1感染组的D(450) 明显低于对照组和空病毒组(P<0.05)。慢病毒介导LATS1感染786-0细胞24、48、72、96 h后,LATS1感染组细胞增殖抑制率分别为4.71%、5.43%、3.70%、16.37%、22.85%,差异有统计学意义(P<0.05),表明慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后对其增殖有明显抑制作用(图 7)。
3 讨论Hippo-YAP信号通路被证明与肿瘤的发生有关,核心因子包括Mast1/2、WW45、Lats1/2、Mob1和YAP,彼此之间相互影响[19],任何一个核心因子发生改变,将会导致组织和器官失控性生长,进而引发肿瘤。研究表明缺失LATS1会导致胶质瘤[8]、宫颈癌[13]、胃癌[14]、皮肤癌[16]、转移性前列腺癌[17]、肾癌[20]等肿瘤的发生,目前LATS1在肾癌中的抑癌机制尚不清楚。
本研究通过慢病毒介导LATS1过表达,以MOI值为60病毒量感染人肾透明细胞癌细胞系786-0 96 h,FCM检测感染效率为83.27%,在荧光显微镜下可见大量的绿色荧光蛋白表达,表明感染成功。采用RT-PCR 和Western blot检测慢病毒介导LATS1感染786-0 细胞后mRNA和蛋白水平,发现上调LATS1能降低YAP mRNA和蛋白水平,其机制可能是LATS1通过PPXY模体与YAP的WW域相互作用使YAP的HXRXXS模体磷酸化,从而在S127位点直接磷酸化YAP,磷酸化YAP通过与14-3-3蛋白和泛素化依赖的相互作用导致其被抑制在细胞质中,从而抑制YAP进入细胞核,导致其转录功能受到抑制[21]。此外,LATS1也能在S381位点磷酸化YAP,引起沉默的酪蛋白激酶1(casein Kinase 1,CK1)连续磷酸化,聚集泛素因子E3,继而降解YAP[22]。
细胞增殖与凋亡的动态平衡维持着机体的稳态,然而肿瘤的发生往往与细胞凋亡受到抑制有关[23],因此,我们采用FCM、CCK-8检测各组细胞凋亡和增殖抑制情况,结果显示LATS1感染组凋亡率明显高于空病毒组和对照组,细胞增殖受到明显抑制并呈时间依赖性。Xia等[24]研究发现上调 LATS1 基因能促进乳腺癌MCF7细胞及肺癌H460细胞凋亡、抑制增殖,其机制可能是通过上调 Bax 蛋白水平来实现。Matallanas等[25]提出上调LATS1能诱导细胞凋亡,可能是LATS1结合并抑制Mdm2,增强p53表达的稳定性,诱导凋亡并抑制其增殖的缘故。
LATS1是一个与细胞周期调控家族(dbf2、orb6、cot-1、ndr和kpm)有关的因子,参与周期调控[26],因此我们利用FCM检测细胞周期发现LATS1感染组停滞于G1期比例显著高于对照组和空病毒组,表明慢病毒介导LATS1感染786-0细胞后诱导其停滞于G1期。Li等[27]在研究中发现3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-diindolylmethane,DIM)能够上调LATS1的表达并诱导人胃癌细胞系SNU-1和SNU-484停滞于G1期,机制可能是DIM通过Mst1/2-LATS1-Mob1复合体激活Hippo信号通路导致YAP磷酸化。
综上所述,本研究通过慢病毒介导LATS1过表达能够下调YAP基因表达,抑制786-0细胞增殖、促进其凋亡并诱导G1期阻滞。LATS1的抑癌机制可能是通过抑制YAP来引起肾癌细胞生物学功能改变,抑制肾癌的进展,因此,深入探讨LATS1的抑癌机制有望为肾癌的诊断和治疗提供新的方向。
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