2 610500 成都，成都医学院：检验医学院;
3 610500 成都，成都医学院：基础医学院
2 School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan Province, 610500, China;
3 School of Basic Medical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan Province, 610500, China
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种神经系统退行性疾病，其重要病理学标志是胞内出现路易小体(lewy body)。研究表明遗传因素、线粒体功能障碍、氧化应激以及蛋白降解异常等许多因素都可以诱导α-突触核蛋白(α-synuclein)的异常聚集[1, 2]，而α-synuclein的异常聚集正是路易小体形成的主要因素[3, 4]。近年来，人们发现自噬溶酶体途径在控制细胞内α-synuclein代谢平衡以及PD的致病过程中均发挥了非常重要的作用[5, 6]。
最近的研究表明在哺乳动物细胞内，存在类似小自噬的内体小自噬途径[7]。这一自噬途径通过热休克蛋白70(heat shock-cognate protein of 70 KDa，Hsc70)识别目标蛋白的LIR结构域(KFERQ)，进而将靶蛋白输送入晚期内体(Late endosome)并经内体小自噬途径降解。Hsc70也能够识别α-synuclein，但是内体小自噬途径在α-synuclein的降解过程中发挥了怎样的作用，目前还不清楚。本研究利用慢病毒介导的shRNA技术分别干扰肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)和溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A，LAMP-2A)的表达，研究抑制内体小自噬途径和分子伴侣介导的自噬途径(chaperon-mediated autophagy，CMA)对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)蛋白降解的影响，以期为进一步研究PD等神经系统退行性疾病的分子机制提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂PC12细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM完全培养基、Opti-MEMI优化培养基和胎牛血清购自Gibco公司。Lipofectamine® 3000转染试剂购自Life公司。质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)购自ENZO公司。BCA蛋白定量试剂盒和Alexa Fluor® 555荧光标记驴抗小鼠IgG购自碧云天生物科技研究所。兔抗LC3B多克隆抗体购自Novus抗体公司，兔抗TSG101单克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司，兔抗LAMP-2A多克隆抗体购自BioVision公司，小鼠抗GFP单克隆抗体和兔抗α-synuclein多克隆抗体购自巴傲得公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体购自成都正能生物技术有限责任公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均购自CST公司。PVDF膜和ECL化学发光试剂购自Millipore公司。嘌呤酶素(puromycin)购自北京索莱宝科技有限公司。人源性pEGFP-alphasynuclein-A53T质粒购自Addgene公司[8]。LAMP-2A和TSG101 shRNA慢病毒、对照慢病毒均由上海汉恒生物科技有限公司提供。
1.2 LAMP-2A和TSG101 shRNA慢病毒载体的构建分别根据GenBank中大鼠LAMP-2A和TSG101基因序列，设计与合成3对shRNA 靶序列。其中，正义链5′端引入BamHⅠ酶切位点，反义链5′端引入EcoRⅠ酶切位点。LAMP-2A shRNA1序列：正义链5′-GATCCG CAGTGCCTGACAAGGTGACATACAA TTCAA GAGA TTGTATGTCACCTTGTCAGGCACTG TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTGAAAAAA CAGTGCCTGACAAGGTGACATACAA TCTCTTGAA TTGTATGTCACCTTGTCAGGCA-CTG CG-3′；LAMP-2A shRNA2序列：正义链5′-GATC-C GCAGAATGGGAGATGAATTTC TTCAAGAGA GAAATTCATCTCCCATTCTGC TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTG-AAAAAA GCAGAATGGGAGATGAATTTC TCTCTTGAA-GAAATTCATCTCCCATTCTGC G-3′；LAMP-2A shRNA3 序列：正义链5′-GATCC GCAGTTGTGGCGATGATAAGA- TTCAAGAGA TCTTATCATCGCCACAACTGC TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTGAAAAAA GCAGTTGTGGCGATGATAAGA TCTCTTGAA TCTTATCATCGCCACAACTGC G-3′。TSG101 shRNA1序列：正义链5′-GATCCG CCCGTAAACAGTTCCAGCTAA TTCAAGAGA TTAGCTGGAACTGTTTACGGG TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTGAAAAAA CCCGTAAACAGTTCCAGCTAA TCTCTTGAA TTAGCTGGAACTGTTTACGGG CG-3′；TSG101 shRNA2序列：正义链 5′-GATCCG CGTCCGTCAAACTGTCAATGT TTCAAGAG-AACATTGACAGTTTGACGGACG TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTGAAAAAA CGTCCGTCAAACTGTCAATGT TCT-CTTGAA ACATTGACAGTTTGACGGACG CG-3′；TSG101 shRNA3序列：正义链5′-GATCCG CCCTGTGCGCTAT-CGAGGTAATATA TTCAAGAGA TATATTACCTCGATAG-CGCACAGGG TTTTTTC-3′，反义链5′-AATTGAAAAAA CCCTGTGCGCTATCGAGGTAATATA TCTCTTGAA TATATTACCTCGATAGCGCACAGGG CG-3′(下划线处为干扰序列)。将合成的DNA单链退火形成双链，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切的慢病毒pHBLV-U6-Puro载体中，转化感受态细胞DH5α，Amp+平板筛选阳性重组子并进行测序鉴定。靶序列设计与合成均由上海汉恒生物科技有限公司完成。
1.3 LAMP-2A和TSG101 shRNA慢病毒的包装与滴度测定取对数生长期的293T 细胞，接种于75 cm2细胞培养瓶中，接种量9×106/孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞密度达80%～90%时，按照汉恒生物LipofiterTM转染试剂说明书操作，将含有重组子的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞。转染48 h 和72 h后分别两次收集病毒上清，以0.45 μm滤器过滤后，于40 mL超速离心管中，72 000×g、4 ℃离心2 h，500 μL新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80 ℃保存。分别取部分慢病毒浓缩液，采用梯度稀释法测定并计算病毒滴度。慢病毒的包装与滴度测定均由上海汉恒生物科技有限公司完成。
1.4 慢病毒感染PC12细胞和稳定感染PC12细胞株的筛选取对数生长期的PC12细胞，接种于24孔板中，接种量5×104/孔，于37 ℃、5% CO2培养24 h，待细胞密度达80%～90%时，以病毒液与培养液体积比1 ∶9的比例，加入对照慢病毒、LAMP-2A和TSG101 shRNA慢病毒进行感染，24 h后，更换新鲜培养液并加入2.5 μg/mL 的puromycin筛选阳性细胞。持续筛选2周后，获得各组慢病毒稳定感染PC12细胞株。
1.5 Western blot检测各组慢病毒稳定感染PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达分别收集对照慢病毒、LAMP-2A和TSG101 shRNA 慢病毒的稳定感染PC12细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，于4 ℃ 14 000×g离心15 min收集裂解上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，每组上样60 μg/泳道，PVDF膜湿转60~80 min，分别加兔抗LAMP-2A抗体(1 ∶1 000)、兔抗TSG101抗体(1 ∶1 000)及小鼠抗β-actin抗体(1 ∶10 000)，4 ℃孵 育过夜，TBST洗膜3次，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶2 000)或山 羊抗小鼠IgG(1 ∶2 000)，37 ℃ 孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法检测相关蛋白的表达。
1.6 下调LAMP-2A和TSG101蛋白对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP、α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白降解的影响分别取对照慢病毒、LAMP-2A shRNA2慢病毒和TSG101 shRNA1慢病毒的稳定感染PC12细胞，接种 于6孔板中，接种量3×105个/孔，当细胞生长至70%融 合时，按照Lipofectamine 3000转染试剂盒说明书进行pEGFP-alphasynuclein-A53T质粒转染，转染量2.5 μg/孔，37 ℃培养4 h后更换新鲜培养液。上述各组转染细胞在37 ℃继续培养36 h后，进行下一步实验。分别进行实验分组：空白对照组(Control组，仅加入D-Hanks 液)，Bafilomycin A1实验组(加入终浓度为0.2 μmol/L 的Bafilomycin A1)。药物处理6 h后，胰酶消化、收集各组细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，于 4 ℃、14 000×g离心15 min，收集裂解上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，每组上样60 μg/泳道，PVDF膜湿转60~80 min，分别加兔抗LAMP-2A抗体(1 ∶1 000)、兔抗TSG101抗体(1 ∶1 000)、小鼠抗GFP抗体(1 ∶2 000)、兔抗α-synuclein抗体(1 ∶1 000)、兔抗 LC3B抗体(1 ∶1 000)及小鼠抗β-actin抗体(1 ∶10 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶2 000)或山羊抗小鼠IgG(1 ∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法检测相关蛋白的表达情况。
1.7 免疫荧光技术检测各组PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达采用Stefanis等[9]的策略来检测PC12细胞中表达的外源性α-synuclein(A53T)蛋白。由于我们使用的兔抗α-synuclein抗体对PC12细胞中内源性表达的α-synuclein蛋白的亲和力较低，而与pEGFP-alphasynuclein-A53T质粒表达的人源性α-synuclein蛋白的亲和力较高，因此Western blot检测到的α-synuclein条带主要为人源性的α-synuclein(A53T)蛋白。分别取对照慢病毒、LAMP-2A shRNA2慢病毒和TSG101 shRNA1慢病毒的稳定感染PC12细胞，接种于放置了多聚赖氨酸包被圆玻片的24孔板中，接种量5×104/孔，当细胞生长至70%融合时，按照Lipofectamine 3000转染试剂盒说明书进行pEGFP-alphasynuclein-A53T质粒转染，转染量1 μg /孔，37 ℃培养4 h后更换新鲜培养液。继续培养36 h后，进行下一步实验。实验分组同1.6。药物处理6 h后，吸去培养基，PBS洗涤3次，冰甲醇-20 ℃固定15 min，PBS洗涤3次，使用含有羊血清和驴血清的封闭液室温封闭1 h，加兔 抗LC3B抗体(1 ∶200)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，再加Alexa Fluor®555荧光标记驴抗小鼠IgG (1 ∶1 000)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，封片，利用荧光显微镜观察照相。
1.8 统计学分析运用SPSS 19.0统计软件，组间均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 慢病毒的制备测序结果显示，6条LAMP-2A和TSG101 shRNA慢病毒载体序列与设计的6对shRNA 靶序列完全一致，表明已经成功地构建了针对LAMP2A和TSG101基因的重组慢病毒载体。将含有重组子的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞后获得重组慢病毒，浓缩后取部分慢病毒浓缩液，采用3倍梯度稀释法测定病毒滴度。经计算得到各组慢病毒滴度均达到2×108PFU/mL，滴度较高，可以用于下一步实验。
2.2 各组慢病毒稳定感染PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达LAMP-2A shRNA-2感染PC12细胞中LAMP-2A蛋白表达的抑制效果最好，而TSG101 shRNA-1感染PC12细胞中TSG101蛋白表达的抑制效果最好(图 1)。因此，选择这2组细胞分别作为下调LAMP-2A和TSG101蛋白的细胞模型用于后续实验。
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| A:LAMP-2A 1:对照慢病毒; 2:LAMP-2A shRNA-1;3: LAMP-2A shRNA-2; 4: LAMP-2AshRNA-3；B: TSG101 1:对照慢病毒; 2: TSG101 shRNA-1; 3: TSG101 shRNA-2; 4: TSG101 shRNA-3 图 1 Western blot检测各组慢病毒稳定感染PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达 |
未加Bafilomycin A1处理的对照慢病毒组细胞(Negative+Control)中的EGFP-α-synuclein(A53T)[E-syn(A53T)]蛋白含量明显较低，与加Bafilomycin A1处理的对照慢病毒组细胞(Negative + Bafilomycin A1)比较差异有统计学意义(P<0.01)，表明Bafilomycin A1抑制了细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)蛋白的降解。同样，未加Bafilomycin A1处理时，仅下调LAMP-2A或TSG101蛋白也能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)蛋白的降解(P<0.01)。而加入BafilomycinA1处理后，与Negative组比较，LAMP-2A shRNA-2组、TSG101 shRNA-1组细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)蛋白表达差异并无显著性(P>0.05，图 2)。
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| A：Western blot检测；B：半定量分析 a: P<0.01,与Nega-tive+Control比较 图 2 Western blot检测各组细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)蛋白的表达 |
Bafilomycin A1处理后，与未加Bafilomycin A1相比，对照慢病毒组细胞中的EGFP蛋白有显著增加(P<0.01)，表明Bafilomycin A1处理抑制了细胞中EGFP蛋白的降解。而LAMP-2A shRNA-2组、TSG101 shRNA-1组与Negative组相比，无论是未加Bafilomycin A1，还是加入Bafilomycin A1处理，细胞中的EGFP蛋白都显著增加(P<0.01，图 3)，表明下调LAMP-2A或TSG101蛋白同样能够抑制细胞中EGFP蛋白的降解。
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| A：Western blot检测；B：半定量分析 a:P<0.01,与 Negative+Control比较;b: P<0.01,与Negative+Bafilomycin A1比较 图 3 Western blot检测各组细胞中EGFP蛋白的表达 |
与EGFP蛋白相似，Bafilomycin A1处理后，与未加Bafilomycin A1相比，对照慢病毒组细胞中的α-synuclein(A53T)蛋白有显著增加(P<0.01)。而LAMP-2A shRNA-2组、TSG101 shRNA-1组与Negative组相比，无论是未加Bafilomycin A1，还是加入Bafilomycin A1处理，细胞中的α-synuclein(A53T)蛋白都有显著增加(P<0.01，图 4)。
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| A：Western blot检测；B：半定量分析 a: P<0.01,与 Negative+Control比较; b: P<0.01,与Negative+Bafilomycin A1比较 图 4 Western blot检测各组细胞中α-synuclein(A53T)蛋白的表达 |
Bafilomycin A1处理后，与未加Bafilomycin A1相比，各组细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值都有显著提高(P<0.01)。未加Bafilomycin A1处理时，LAMP-2A shRNA-2组、TSG101 shRNA-1组与Negative组相比，细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也都有显著提高(P<0.01)。而加入Bafilomycin A1处理后，LAMP-2A shRNA-2 组、TSG101 shRNA-1组与Negative组相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差异并无显著性(P>0.05，图 5)。
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| A：Western blot检测；B：半定量分析 a:P<0.01，与 Negative+Control比较 图 5 Western blot检测各组细胞中LC3B蛋白的表达 |
未加Bafilomycin A1处理时(Control)，各组细胞形态较为正常，与Negative组细胞相比，LAMP-2A shRNA-2组和TSG101 shRNA-1组细胞内EGFP-α-synuclein(A53T) 聚集体明显增多，LC3B自噬斑点也有增加。加入Bafilomycin A1处理后，各组细胞均发生皱缩，EGFP-α-synuclein(A53T) 聚集体和LC3B自噬斑点也显著增多(图 6)。
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| 图 6 荧光显微镜下观察EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达 (×400) |
近年来的研究表明自噬溶酶体途径在调节细胞内α-synuclein代谢平衡中发挥了非常重要的作用。经典的自噬溶酶体途径可以分为3种类型：大自噬途径(macroautophagy)、小自噬途径(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬途径(CMA)[10]。大自噬途径是通过形成脂质双层膜包裹待降解目标蛋白或细胞器，并将其融入溶酶体内降解。已有研究证实ubiquitin-p62信号通路可以特异性的识别不溶性α-synuclein聚集体以及突变型α-synuclein并经大自噬途径降解，从而阻止其对细胞造成的损害[11]。CMA途径依赖分子伴侣对底物的特异识别作用，研究表明热休克蛋白 Hsc70可以识别野生型α-synuclein，然后通过与溶酶体膜蛋白LAMP-2A作用，从而将野生型α-synuclein 导入溶酶体内经CMA途径降解。但是，CMA途径不能降解突变型α-synuclein或α-synuclein聚集体[12, 13, 14]。 小自噬途径是溶酶体直接包裹降解蛋白质或细胞器的自噬方式，尽管小自噬途径已在酵母细胞内得到广泛证实并进行了深入研究[15, 16]，然而在哺乳动物细胞内，关于小自噬途径的研究还很少，其在调控α-synuclein代谢中的作用也不清楚。最近的研究表明在哺乳动物细胞内，存在类似小自噬的内体小自噬途径[7]。这一作用同样依赖于Hsc70对目标蛋白的LIR结构域(KFERQ)的识别，进而将靶蛋白输送入晚期内体并经溶酶体降解。那么，α-synuclein是否也能通过内体小自噬途径降解，目前还不清楚。
突变型α-synuclein(A53T)基因是家族遗传性PD的致病基因之一，由于CMA途径对α-synuclein的空间结构有一定限制，α-synuclein(A53T)蛋白被Hsc70识别并结合到溶酶体膜表面后，不能通过CMA途径降解，因此会抑制CMA途径功能，导致其他CMA底物蛋白的聚集，并引起细胞死亡[17, 18]。内体小自噬途径可以通过直接包裹的方式降解底物[7]，因此，与CMA途径只能降解野生型α-synuclein不同，我们推测内体小自噬途径也能降解突变型α-synuclein甚至α-synuclein聚集体。在本研究中，我们选择EGFP-α-synuclein(A53T)融合蛋白作为底物蛋白研究内体小自噬途径在降解α-synuclein中的作用。
Bafilomycin A1是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，能够破坏溶酶体腔内的低pH环境，从而抑制溶酶体内的蛋白酶活性，并阻断自噬溶酶体的形成，因此对所有类型的自噬都有抑制作用[19]。在本研究中，我们利用Bafilomycin A1处理PC12细胞，结果显著提高了对照病毒组感染细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的含量，表明细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)的确主要通过自噬溶酶体途径降解。
溶酶体膜蛋白LAMP-2A是CMA 途径中的关键调节蛋白，抑制LAMP-2A蛋白表达可以特异性地阻断CMA 途径，而不影响大自噬和小自噬等其他自噬途径[20, 21, 22]。我们利用慢病毒介导的shRNA技术干扰溶酶体膜蛋白LAMP-2A的表达，发现阻断CMA途径后，细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)的含量均有了显著增加，提示阻断CMA途径能够抑制EGFP-α-synuclein(A53T) 的降解。我们推测其原因可能是因为阻断CMA途径能够引起CMA底物蛋白的聚集和代偿性的大自噬降解作用，进而干扰了EGFP-α-synuclein(A53T) 通过大自噬途径的降解过程。
内体小自噬途径需要内体分选复合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)Ⅰ和Ⅲ的参与[7]，TSG101是ESCRT Ⅰ的关键调控因子[23]，抑制TSG101蛋白表达可以特异性地阻断内体小自噬途径[7, 20]。为了验证内体小自噬途径在EGFP-α-synuclein(A53T)降解中的作用，我们利用慢病毒介导的shRNA技术特异抑制TSG101的表达，结果显示阻断内体小自噬途径能够诱导细胞内EGFP-α-synuclein(A53T) 、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的聚集，提示内体小自噬途径在细胞内EGFP-α-synuclein(A53T)的降解中可能也发挥了一定的作用，但是这一结果也有可能是因为阻断内体小自噬途径，引起其底物蛋白的聚集和大自噬功能紊乱所导致，还需要进一步的实验来证实。
本研究结果表明：下调LAMP-2A和TSG101蛋白都能够引起细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达增加。LC3-Ⅱ是衡量大自噬水平的一个重要因子[24]，但是细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达增加，既可能是大自噬途径被激活引起，也有可能是自噬体与溶酶体的融合受阻而积聚产生。已有研究认为下调LAMP-2A引起的LC3-Ⅱ蛋白增加，是由于大自噬代偿性升高所导致的[13, 20]。因此，我们推测下调TSG101，抑制内体小自噬途径后，也会引起大自噬水平的代偿性升高。
综上所述，本研究结果提示：除了大自噬途径，内体小自噬途径也可能参与了细胞内α-synuclein(A53T)蛋白的降解过程，但是其具体机制还不清楚。而进一步研究内体小自噬途径在降解突变α-synuclein以及清除α-synuclein异常聚集中的作用，将为深入阐释PD的发生机制提供新的思路。
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