2. 401331 重庆， 重庆医科大学附属大学城医院神经内科
2. Department of Neurology,Affiliated University City Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,401331,China
阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD)作为痴呆最常见的原因，主要临床表现为持续进行性认知功能障碍；特征性病理改变为细胞外老年斑 (senile plaques,SP) 沉积、细胞内神经原纤维缠结和神经元丧失等。目前对该病的发病机制尚不完全清楚。β淀粉样蛋白 (amyloid beta peptide,Aβ) 级联代谢学说认为，脑内Aβ过度形成和老年斑沉积启动了AD的发病过程并起关键作用[1]，因此减少不溶性Aβ的产生成为研究和治疗AD的靶点。
既往研究发现，内源性硫化氢 (hydrogen sulfide,H2S) 降低可能通过多种途径参与AD的发生、发展，补充外源性H2S可以改善痴呆小鼠认知功能[2]。本课题组近期研究发现，作为中枢神经系统内重要H2S合成酶的胱硫醚-β-合酶 (cystathionine-β-synthase,CBS) 在9、12月龄APP/PS1小鼠脑组织内表达明显减少，且与H2S含量降低呈正相关[3]，但是不明确CBS过表达后H2S含量、Aβ代谢及小鼠认知功能等变化。因此，本实验通过建立APP/PS1转基因小鼠脑组织内CBS过表达模型，观察内源性H2S含量、Aβ水平及小鼠认知功能等变化。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器兔抗多克隆CBS抗体(ab135626，Abcam)，兔抗多克隆Aβ1-42抗体(bs-0107R，北京博奥森)，生物素标记羊抗兔IgG(SA00004-2，武汉三鹰)，免疫组化染色试剂盒(SP-9001，中杉金桥)，离子计(PXSJ-226，雷磁)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010，碧云天)；CBS高表达慢病毒颗粒由上海吉凯公司包装合成；小鼠脑立体定位仪、Morris水迷宫及分析软件等设备由重庆医科大学实验室提供。
1.2 动物分组及处理APP/PS1双转基因小鼠(APPswe× PS1E9)由南京大学模式动物研究所提供，另取同窝野生型小鼠作为空白对照。饲养环境宽松，室温及空气湿度恒定，饮食规律，昼夜节律正常。选用12月龄鼠，不分雌雄，体质量25~30 g，分为3组，每组9只。A组：野生型+空载病毒组；B组：转基因型+空载病毒组；C组：转基因+CBS病毒组，注射高效价CBS高表达慢病毒。4周后即进行水迷宫测试及后续实验。
1.3 慢病毒载体注射6%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔麻醉后，将小鼠固定于脑立体定位仪，头顶部常规备皮、消毒，暴露前囟部位。按小鼠脑立体定位图谱进行定位，确定前后囟在同一水平线后，以前囟为零点，将2 μL CBS过表达慢病毒或空载病毒以0.50 μL/min的速度注入海马(AP-2.3，ML-2.0，DV-1.7)，留针约5 min后缓慢拔针，缝合消毒，待其苏醒。术后注意保温。
1.4 水迷宫实验实验过程中保持环境安静，空间参照物品位置不变，以排除外界干扰。整个实验共计6 d，分别为连续5 d的定位航行实验和第6天的空间搜索实验。
定位航行实验：小鼠每天训练4次，每次从不同象限入水，每次训练间隔1 h。记录小鼠寻找平台所需时间(逃避潜伏期)。若小鼠没有在90 s内找到平台，按90 s计算逃避潜伏期。空间搜索实验：第6天撤去平台，选择离平台最远的象限入水，记录小鼠在90 s内穿越平台所在位置的次数。
1.5 免疫组织化学染色取海马组织石蜡包埋，冠状位连续切片，按S-P三步法进行标本染色，检测CBS、Aβ1-42 。具体步骤按免疫组化试剂盒说明书进行：将切片放入60 ℃恒温烤箱中60 min。二甲苯脱蜡，梯度酒精复水；微波法修复抗原并自然冷却至室温；滴加3% H2O2去离子水，室温5~10 min；滴加山羊血清(勿洗)，室温10~15 min；配置适当比例稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜(CBS 1 ∶100；Aβ1 ∶150)；次日依次加入二抗、辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10~15 min。各步骤间用PBS溶液漂洗5 min×5次。最后DAB显色、复染、脱水、透明、中性树脂封片。染色完毕后，光学显微镜下观察阳性表达并照相。
1.6 敏感硫电极法敏感硫电极法根据H2S的理化特性，通过检测微量S2-浓度，间接换算出组织中内源性H2S的含量。电极在每次使用之前需在去离子水中活化2 h以上；一个样品测定结束，需再次放入去离子水中以保持活化状态。
称取新鲜剥离的海马组织50 mg，加入生理盐水制备成质量分数为10%的组织匀浆；将组织匀浆加入锥形反应瓶(瓶底中央有直径1.0 cm，高度0.8 cm的中央孔)，再加入0.5 mL 1 mol/L HCl促使组织释放H2S，向中央孔内加入0.5 mL 1 mol/L NaOH 以吸收生成的H2S并转化为S2-；迅速封口后置于37 ℃水浴摇床孵育4 h；取中央孔液体进行测定，利用标准曲线计算出S2- 浓度。剩余组织匀浆根据BCA测定蛋白浓度，组织H2S含量以nmol/mg表示。
1.7 ELISA检测Aβ1-42水平采集新鲜海马组织制备组织匀浆，离心后取上清液备用。实验前需将试剂平衡至室温。
实验严格按照试剂盒说明书进行，具体步骤如下：将标准品及处理后的待测样品按每孔各50 μL依次加入包被微孔板，再分别加入25 μL酶联亲和物，覆膜，37 ℃ 孵育反应60 min后充分弃尽孔内液体，用清洗液冲洗5次，并扣干孔内剩余液体。每孔依序分别加入底 物Ⅰ和Ⅱ各50 μL，室温下避光反应15 min。反应 过后每孔加入终止液50 μL，终止反应。在30 min内使用酶标仪读取光密度值[D(450)]。在标准曲线图上查找出每个待测样本对应的浓度范围，结果以pg/mL 表示。
1.8 统计学处理所有数据用x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行重复测量数据的方差分析及单因素方差分析。
2 结果 2.1 水迷宫行为学检测 2.1.1 定位航行实验各组小鼠逃避潜伏期见表 1，在定位航行实验训练中，各组小鼠平均逃避潜伏期均呈下降趋势。与A组小鼠相比，B组小鼠潜伏期均延长(P < 0.01)；C组和B组相比，在第1、2、3天，潜伏期有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，第4、5、6天潜伏期有统计学差异(P < 0.05,P < 0.01)，且第4天差异更为明显(P<0.01)。
| 组别 | 逃避潜伏期(s) | 穿越平台次数 | |||||
| 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | 第6天 | ||
| 野生型+空载病毒组 | 46.33±8.52 | 41.47±5.81 | 35.60±6.43 | 24.38±4.45 | 20.84±4.61 | 17.15±5.58 | 6.67±2.50 |
| 转基因型+空载病毒组 | 56.02±5.73 a | 53.31±5.56 a | 46.56±6.20 a | 41.83±5.55 a | 33.68±5.47 a | 31.53±5.04 a | 2.23±1.56 a |
| 转基因型+CBS病毒组 | 53.56±5.39 | 49.76±4.86 | 43.05±3.45 | 34.39±4.35 c | 28.56±3.80 b | 25.50±3.32 b | 4.56±1.88 b |
| a： P<0.01，与A比较； b： P<0.05，c： P<0.01，与B组比较 | |||||||
撤去平台后各组小鼠在90 s 内穿越平台次数见表 1。与A组小鼠相比，B组小鼠穿越平台次数明显减少(P < 0.01)；过表达CBS后，C组小鼠穿越平台次数较B组有所增加(P < 0.05)。
2.2 海马组织中CBS蛋白表达各组小鼠脑组织中均可见CBS蛋白阳性表达，为棕黄色颗粒，主要为分布于神经元胞膜上。与A组相比，B组阳性表达数量明显减少，颜色变浅；C组较B组阳性表达增加，颜色变深(图 1)。
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| A：野生型+空载病毒组；B：转基因型+空载病毒组；C：转基因型+CBS病毒组 图 1 各组海马组织内CBS蛋白表达比较(S-P ×400) |
经敏感硫电极测定，B组小鼠海马组织内H2S(8.62± 0.75)nmol/mg较A组含量(14.94±1.28)nmol/mg 明显降低(P < 0.01)；过表达CBS后，C组小鼠海马组织内H2S(10.52±1.60)nmol/mg较B组含量有所增加，且差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.4 各组小鼠海马组织中Aβ1-42含量及老年斑分布情况ELISA检测各组小鼠海马组织内Aβ1-42含量，发现与A组(256.42±73.10)pg/mL相比，B组含量(610.06±82.94)pg/mL明显增多(P < 0.01)；过表达CBS后，C组Aβ1-42含量(481.09± 96.15)pg/mL较B组明显减少(P < 0.01)。在光镜下观察，Aβ1-42沉积形成的老年斑呈菊花状斑块，周边为退变神经轴突，中央颜色较深，为淀粉样物质(图 2)。在A组海马组织中几乎没有看到明显的斑块形成；B组和C组海马中均可见阳性表达；与B组相比，C组淀粉样斑块直径变小，数量减少。
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| A：野生型+空载病毒组；B：转基因型+空载病毒组；C：转基因型+CBS病毒组 ↑：示老年斑 图 2 各组海马组织内老年斑分布情况(S-P ×40) |
目前，AD的病因及发病机制尚不清楚，治疗也缺乏针对性。Aβ被认为在AD的发病中起关键作用[4]。Aβ由APP经β位淀粉样前体蛋白裂解酶-1(β-site APP cleaving enzyme-1，BACE-1)和γ分泌酶(γ-secretase)酶切产生[5]。当Aβ在脑内异常沉积时，可引发炎症、氧化应激、神经元丧失，并引起Tau蛋白异常磷酸化、轴突损伤、突触丢失最终导致患者失智和失认[6]。因此，减少Aβ的生成可能是治疗AD的途径 之一。H2S作为第3种内源性气体信号分子，在哺乳动物体内发挥重要生理作用。体内的H2S主要由3种 酶合成，分别是CBS、胱硫醚-γ-合酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfur transferase，3MST)，其中，CBS和3MST主要在中枢神经系统表达[7, 8]。
1996年日本学者首次发现H2S在中枢神经系统内可以选择性地提高N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体介导作用并有助于促进海马长时程增强、参与学习记忆调节[9]；另有报道指出，与健康成年人相比，AD患者脑组织中H2S水平明显降低[10, 11]。这些研究提示，脑组织中H2S含量减少可能与AD发生具有一定的联系。
本课题组前期研究发现，AD患者血浆内H2S含量较健康人明显降低，且与疾病严重程度呈负相关[12]；随后，我们在APP/PS1转基因小鼠脑组织中同样发现H2S水平降低的现象，当外源性补充NaHS后，小鼠认知功能可得到一定改善；之后我们进一步研究发现，NaHS可以通过PI3K/AKT通路降低BACE-1、PS1的mRNA及蛋白表达水平，使APP的代谢向非淀粉样物质途径进行转换，从而减少Aβ产生[3, 13]。
既往研究发现，在AD模型鼠脑组织内Aβ异常沉积所诱导的炎症介质释放可以引起CBS的下调并最终导致H2S合成下降[14]。本课题组前期实验亦证实，CBS在APP/PS1转基因小鼠脑组织内的表达随年龄的增长逐渐下降，而H2S水平的降低呈现相同趋势。我们推测，作为中枢神经系统内重要的H2S合成酶，CBS在脑组织中的表达失调影响了H2S合成，最终通过多种途径参与AD的发生、发展。
为了验证CBS对H2S生成及小鼠认知功能的影响，我们进行了本实验。结果显示，12月龄APP/PS1双转基因小鼠较同窝野生型小鼠认知功能明显减退，且脑组织内Aβ1-42含量及老年斑沉积明显增多，说明双转基因鼠能够较好地模拟出AD的行为学变化及病理特征。接着我们检测到双转基因小鼠脑组织内CBS蛋白及H2S含量较野生型小鼠降低更为明显，当我们向双转基因小鼠脑组织注射CBS过表达慢病毒后，CBS蛋白表达数量增加、H2S含量也相应增多，与此同时，脑组织内Aβ1-42含量及老年斑沉积显著减少，短期内小鼠的空间学习与记忆能力也有所改善。因此我们推测，增加脑组织内CBS表达可以通过提高内源性H2S水平最终达到改善小鼠认知功能的目的。
目前关于H2S与AD相关性的研究均把NaHS作为外源性H2S供体，尚不能准确还原哺乳动物体内生理状态。本实验通过慢病毒注射的方法提高内源性H2S含量，更能反映出模型动物体内CBS表达与H2S含量变化的真实情况，具有较大的参考价值。下一步，我们将进一步研究针对CBS过表达减少Aβ产生的具体机制及可能经过的信号通路。
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