甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种叶酸拮抗剂，通过抑制叶酸代谢途径中的二氢叶酸还原酶达到抗细胞增殖的作用^[1]。大剂量的MTX常用于肿瘤、白血病的治疗，最新的儿童急性淋巴性白血病诊疗方案提出甲氨蝶呤使用剂量为2~5 g/(m²·24 h)，患者血清浓度可高达20 μmol/L^{[2, 3, 4]}。常用检测方法主要有高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、酶放大免疫法^{[3, 4, 5, 6, 7]}。近年来MTX用于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、干燥综合征、银屑病关节炎等系统性自身免疫性疾病的治疗，常用剂量为5~20 mg/周，患者服药后24 h内血清MTX浓度最高为20 nmol/L，两者浓度相差了近1 000倍^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}。传统的检测方法很难检出，现常用高效液相色谱质谱法检测^{[9, 10]}，但色谱质谱法样本前处理较复杂，操作步骤也相对繁琐^[11]，且色谱质谱仪造价昂贵，检测成本高，不适合与大样本检测及基层开展。因此，建立一种稳定、快速、简便、成本低的MTX检测方法具有重要意义。本实验将NH₂活性生物素(NH2-reactive biotin，BNHS)与MTX单抗IgG化学连接，采用亲和素-HRP酶标记系统，建立放大竞争酶联免疫吸附法，可用于检测人体血清中MTX浓度。以期为监测MTX在患者体内的代谢、分布、吸收提供简便、有效的方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

NH₂活性生物素(NH₂-reactive biotin，BNHS)、MTX单抗IgG(武汉Elabscience公司)，辣根过氧化物酶标记的链亲和素SA-HRP(美国Sigma公司)，MTX标准品(中国药品生物制品研究所)，标记缓冲液(Labeling Buffer，LB)、四甲基联苯胺TMB(重庆予之生物公司)。 1.1.2 设备

洗板仪(BIOTEK ELX50)、酶标仪(BIOTEK ELX800)、恒温孵育箱(上海仪器厂 lw600)。 1.1.3 样本来源

实验用口服MTX的RA患者血清为患者检测完肝肾功后血清。 1.2 方法 1.2.1 NH₂活性生物素标记MTX单抗IgG

取 1 mg MTX单抗IgG于1.5 mL离心管中，并加入0.5 mL LB；加入15 μL BNHS和475 μL LB至离心管中，37 ℃ 恒温箱中避光温育30 min。加入适量0.5 mL LB至离心管中，并轻吹打混匀，12 000×g离心10 min。 加0.2 mL LB至离心管中，轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6 000×g离心10 min。 1.2.2 BA-c ELISA的测定步骤

用CBS溶液溶解MTX，100 μL包被96孔酶标板，4 ℃下放置过夜。次日用SPBST溶液250 μL 37 ℃封闭2 h，加入NH₂活性生物素标记MTX单抗IgG 50 μL和MTX溶液或者待检血清50 μL 37 ℃温育。用300 μL PBST洗液洗涤3次，再加入SA-HRP 100 μL 37 ℃温育30 min，用300 μL PBST洗液洗涤3次，加入TMB避光37 ℃温育15 min，加入50 μL终止液终止反应，450 nm测定光密度值[D(450)]。 2 结果 2.1 BNHS标记MTX单抗IgG滴度测定

将BNHS标记MTX单抗IgG以10倍比稀释后，C₀为储备液浓度，C为倍比稀释后工作液浓度。应用直接ELISA的方法，测定标记后抗体与包被于酶标板上的MTX反应浓度，MTX包被浓度为2 μg/mL，用空白SPBST溶液做对照，结果说明BNHS标记MTX单抗IgG可特异性与MTX结合(图 1)。

图 1 BNHS标记MTX单抗IgG滴度测定

图选项

分别以8、4、2、1 μg/mL和0.5 μg/mL的MTX抗原包被96孔酶标板，加入10倍比稀释的将BNHS标记MTX单抗IgG溶液，C₀为储备液浓度，C为倍比稀释后 工作液浓度，采用直接ELISA方法，检测反应光密度值，结果显示：1.0 μg/mL的抗原为最优包被浓度，在此包被浓度下，光密度值下降，最快的抗体稀释度为10³~10⁴ 。 2.3 BNHS标记MTX单抗IgG抗体与SA-HRP反应浓度及反应时间、温度确定

实验最佳条件为：BNHS标记MTX单抗IgG抗体稀释度为3 200倍，SA-HRP最佳稀释度为2倍，反
应温度为37 ℃，反应时间30 min。 2.4 标准曲线建立2.4 标准曲线建立

对所获得的标准曲线采用四参双Log曲线拟合法(图 2A)，由于在0.1~10 ng/mL，曲线为良好的线性关系，且此段的斜率最大，根据Log(A)对Log(C)进行回归分析，得到一条直线(图 2B)，由图 2B可以得出：

y=-0.477 2x-0.147 2,R²=0.990 2。

A：四参双Log曲线；B：标准曲线图 2 MTX BA-cELISA的标准曲线

图选项

测定30份空白SPBST溶液，运用四参双Log曲线拟合法计算，均值 为 0.110 ng/mL，标准差SD为0.009 ng/mL，以 +3SD为最低检测限，理论上本方法的检测下限为0.137 ng/mL，但考虑到实际检测工作的需要和可能的误差，我们将本方法的检测下限设定为0.2 ng/mL。对标准曲线的零标准重复10次测定，均值 为0.097 ng/mL，标准差SD为0.005 ng/mL, -2SD为测定灵敏度，检测灵敏度为0.087 ng/mL。 2.5.2 准确度

将MTX添加到SPBST溶液中，配置0.2、1、2.5、5、7.5、10 ng/mL MTX溶液，设5个重复，以回收率和RSD确定其准确度。结果见表 1。

以批间、批内差异来确定本方法的精密度，分别设1、2.5、5、7.5 ng/mL 4个水平的待测样本，同一样本分别测5个批次，每个批次分别测5次。结果见表 2。

检测32例口服MTX的RA患者血清中MTX含量，将患者血清稀释10倍后，测得26有效血药浓度0.4~3.35(2.4±0.27)ng/mL，有6例患者血清中未检测出MTX。 3 讨论

ELISA是一种简便、灵敏度及特异度高的检测方法，广泛用于各种血药浓度检测。传统双抗夹心ELISA法可检测MTX的血药浓度为μg/mL数量级^{[7, 8, 9, 10, 11, 12]}，可用于大剂量MTX使用患者的血药浓度检测。小剂量治疗量的自身免疫性疾病患者血清中MTX浓度为ng/mL数量级，传统的ELISA检测方法无法检测MTX小剂量治疗量患者血清中药物浓度^{[13, 14, 15, 16]}。 生物素-亲和素之间的亲和常数可达10¹⁵L/mol，且一个亲和素分子可标记多个酶分子^[12]，因而可提高反应体系的灵敏度，与常规双抗夹心ELISA法相比可将线性范围及检测限向下扩展2~3个数量级^[16]。因此本研究采用生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤，并对该方法检测效能进行评估。

本研究将NH₂活性生物素与MTX单抗IgG化学连接，采用亲和素-HRP酶标系统，建立了放大竞争ELISA法。本方法的检测灵敏度为0.087 ng/mL，较之前的方法检测灵敏度、检测下限、检测范围向下扩展了3个数量级。且本实验的四参双Log曲线拟合法(R²=0.996 2)。本实验回收率平均为103.0%；RSD平均为13.5%，小于15%，表明本方法具有较高的准确度。平均批内差异为6.5%，平均批间差异为8.3%，均小于10%，表明本方法具有较好的精密度。检测口服MTX的RA患者血清中MTX血药浓度0.4~3.35 ng/mL，与其他报道基本相符^{[9, 10]}。因此，本实验所建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法可用于临床MTX血药浓度的检测。