脉络膜新生血管(choroidal noevascularization,CNV)参与多种眼底疾病的发生,如年龄相关性黄斑变性、特发性脉络膜视网膜炎等,是目前致盲的最重要因素之一,且发病率近年有所增长。尽管CNV形成的研究不断进展,但其发病机制极其复杂,至今尚不完全明确。近年研究发现神经轴突导向因子slit2参与新生血管形成[1, 2]。slit2是一种分泌型糖化蛋白,主要分布在肺、肾、神经、实体肿瘤等,参与血管新生、细胞迁移,调节肿瘤的增殖、凋亡,调控白细胞趋化等[3]。但slit2是否也参与CNV形成的研究尚少见报道。本课题组前期研究证明沉默视网膜色素上皮细胞(RPE)中的slit2基因,可使缺氧诱导的血管内皮生长因子(VEGF)降低,而后者是促进CNV形成的重要因子,因此认为slit2可能参与CNV的形成[4]。本实验利用腺病毒转染技术,使RPE细胞中slit2基因过表达,观察过表达slit2的RPE细胞对猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)的迁移及管腔形成的影响,为CNV的治疗提供新的靶点。
1 材料与方法 1.1 实验细胞人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞系由本课题组提供,RF/6A购自中国上海中科院细胞库。
1.2 实验试剂Ad-slit2、Ad-null(长沙赢润生物技术有限公司),RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶(美国Gibco公司),磷酸盐缓冲溶液(PBS)、青霉素-链霉素混合液、SDS-PAGE制胶试剂盒、SDS上样缓冲液(中国碧云天公司),RT-PCR试剂盒、Prime ScriptTM RT reagent kit、SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ(日本TaKaRa公司),ELISA试剂盒、山羊抗兔抗体(武汉博士德公司),兔抗人slit2抗体(美国Abcam公司),兔抗人VEGF抗体(美国Immunoway公司),Matrigel胶(美国BD公司),Transwell小室(美国Corning公司)等。
1.3 细胞培养RPE细胞及RF/6A细胞均用含10% FBS、1%青霉素-链霉素混合液的RPMI1640培养基,置于37 ℃,5% CO2条件下的孵箱内培养。按细胞传代方法,将RPE细胞消化成悬浮状体,种于6孔板或24孔板中,分成3组:空白对照组、Ad-null转染组、Ad-slit2转染组。待其贴壁成对数成长时,按1 ∶1 000的比例分别将Ad-slit2、Ad-null分别加入孔内的培养基中,将板置于孵箱内,孵育24 h及48 h后收集细胞做检测。
1.4 RT-PCR检测按RT-PCR试剂盒说明,提取各组细胞总mRNA,并逆转录为cDNA。slit2上游引物5′-GGGCATTTGAT-ACTCCATTC-3′,下游引物 5′-TCTTCTTTCTCAGCCAC-TCTCC-3′,104 bp;VEGF上游引物5′-GAGTACATCTTCAAGCCATCCTG-3′,下游引物5′-TGCTCTATCTTTC-TTTGGTCTGC-3′,204 bp;β-actin上游引物5′-GTGAT-CTCCTTCTGCATCCTGT-3′,下游引物 5′-CCACGAAAcTACCTTCAACTCC-3′,132 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ实时PCR总反应体系是25 μL:Premix Ex TapTM Ⅱ 12.5 μL、上游引物(10 μmol/L)及下游引物(10 μmol/L)均1 μL、模板2 μL 、无酶DNase 8.5 μL。反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,均扩增40个循环。循环结束后进行产物溶解曲线测定。根据2-△△Ct法计算slit2、VEGF的相对含量。
1.5 Western blot检测收集各组细胞,加入蛋白酶抑制剂和裂解液的混合液(按1 ∶100比例混合),吹打混匀,静置5 min后再次吹打,反复6次后,在4 ℃离心机里离心15 min,吸出上清,即为总蛋白。按BCA蛋白定量试剂盒说明,测量各组总蛋白的浓度。按SDS-PAGE制胶试剂盒的说明配制分离胶和浓缩胶,加样后电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭2 h,孵抗slit2或抗VEGF抗体,4 ℃过夜,洗膜后孵二抗,37 ℃静置2 h,洗膜后曝光显影。
1.6 ELISA检测收集各组细胞的上清培养基,离心后去沉淀取上清,用样本稀释液按1 ∶1稀释上清备用。按照人VEGF ELISA试剂盒说明操作,检测标准品及各组光密度值。根据标准曲线,计算各组VEGF的含量。
1.7 迁移实验(Transwell小室法)将1×105/mL的RPE细胞种于24孔板中,加入600 μL培养基,待其呈对数生长期时,加入Ad-slit2、Ad-null,转染24、48 h后,将种有密度为1×104/mL RF/6A细胞的Transwell小室(孔径为8.0 μm)放入孔中,建立共培养模式,在37 ℃、5% CO2条件下孵育48 h后,取出小室,用棉签将小室上层细胞擦掉,用 5%多聚甲醛 固定15 min,再用1%结晶紫染色15 min,在显微镜下观察并随机取5个视野照相,计算每一视野下RF/6A细胞的迁移数目。
1.8 管腔形成实验(Matrigel胶体外三维成型法)将1×104/mL RPE细胞种于Transwell小室(孔径为0.4 μm)中,加入100 μL培养基,细胞贴壁后加入Ad-slit2及Ad-null,转染24、48 h后备用。按1 ∶1将Matrigel胶和RPMI1640培养基混合均匀,加入24孔板中,每孔加200 μL,置于37 ℃的孵箱1 h,基质胶凝固。将1×105/mL的RF/6A细胞种于各孔的基质胶上,加600 μL培养基。将Transwell小室放入孔中,建立共培养体系,放入37 ℃、5% CO2的孵箱孵育24 h后,取出小室。在显微镜下观察各孔中RF/6A细胞的管腔形成情况,随机选5个视野照相,计算形成管腔个数,并用Image-pro软件计算其管腔形成的总长度。
1.9 统计学分析实验重复至少3次。采用SPSS 17.0统计软件,计量数据用 ±s表示,进行单因素方差分析及t检验。
2 结果 2.1 Ad-slit2转染对RPE细胞slit2 mRNA及蛋白表达的影响RT-PCR结果显示Ad-slit2转染RPE细胞24、48 h后,RPE细胞中slit2 mRNA均较空白对照组表达明显提高,差异具有统计学意义(F=654.11,P < 0.05),而其阴性对照组,即Ad-null转染24、48 h组,较空白对照组无明显变化(P>0.05,图 1A)。Western blot显示Ad-slit2转染24 h及48 h组,RPE细胞中slit2蛋白表达水平比空白对照组明显提高;而阴性对照组均较空白对照组无明显变化(P>0.05,图 1B)。
2.2 Ad-slit2转染对RPE细胞中VEGF mRNA及蛋白表达的影响RT-PCR结果显示,Ad-slit2转染24 h及48 h组RPE细胞中VEGF mRNA表达量均显著高于空白对照组,差异具有统计学意义(F=66.816,P < 0.05);而阴性对照组,即Ad-null转染24、48 h组,均较空白对照组无明显变化(P>0.05,图 2A)。Western blot结果显示Ad-slit2转染24、48 h后,RPE细胞中VEGF蛋白表达水平均较空白对照组明显提高(图 2B)。
2.3 Ad-slit2转染对RPE细胞培养基上清液内VEGF分泌水平的影响ELISA结果显示Ad-slit2转染于RPE细胞24、48 h后,其培养基上清液中分泌型 VEGF均较空白对照组分泌量增多,差异具有统计学意义(F=30.69,P < 0.05);而Ad-null转染24、48 h组,均较空白对照组无明显变化(P>0.05,图 3)。
2.4 迁移实验Ad-slit2转染24、48 h后,RPE细胞对RF/6A细胞的迁移数目[(67.7±4.2)、(79.7±3.5)个]均较空白对照组[(40.6±4.5)个]增多,差异具有统计学意义(F=81.16,P < 0.05);而阴性对照组,即Ad-null转染24、48 h组[(36.7±3.5)、(36.0±3.6)个],与空白对照组比较无明显变化(图 4)。
2.5 管腔形成实验与空白对照组比较,Ad-slit2转染24 h及48 h组,在每一视野下RF/6A细胞形成管腔总长度及管腔数均明显增加,差异具有统计学意义(F=59.66,P < 0.05;F=9.676,P < 0.05);而阴性对照组,即Ad-null转染24、48 h组,均较空白对照组无明显变化(P>0.05,表 1、图 5)。
组别 | 管腔长度(mm) | 管腔形成个数 |
空白对照组 | 3.95±0.31 | 8.7±3.2 |
Ad-null转染24 h组 | 4.53±0.26 | 8.9±3.6 |
Ad-slit2转染24 h组 | 6.04±0.34 a | 15.0±4.2 a |
Ad-null转染48 h组 | 4.09±0.18 | 8.3±2.4 |
Ad-slit2转染48 h组 | 7.27±0.45 a | 23.0±4.5 a |
a:P < 0.05,与空白对照组比较 |
slit基因最早于1984年由Nusslein-Volhard等在果蝇的中枢神经系统发现,其家族在脊椎动物中存在 3个亚型,即slit1、slit2、slit3,并有4种受体,即Robo1~ 4[5]。其中slit2与新生血管的发生关系密切,成为时下研究热点。然而slit2对新生血管形成所起的作用存在分歧。Wang等[6]研究发现slit2表达于恶性黑色素瘤细胞,且促进肿瘤诱发的血管形成;Wang等[7]在口腔鳞状细胞癌的研究中也证明了slit2/Robo1在癌变过程中参与激活血管形成,经slit2/Robo1特异性阻断剂R5处理后,肿瘤的血管形成受到抑制。但也有一些研究得到的却是相反的结论,如Han等[8]研究表明slit2参与角膜新生血管的形成,且slit2与robo1及robo4的相互作用抑制角膜新生血管形成;Jones等[9]研究发现通过slit2激活robo4在体外可抑制血管内皮生长因子(VEGF)所诱导的血管形成,在体内可通过阻断Scr家族激酶活化抑制VEGF所刺激的血管渗漏。综上表明,slit2处在不同环境下,对新生血管形成所起作用亦有所不同。
脉络膜新生血管形成的病理基础是脉络膜毛细血管突破bruch膜侵入RPE层,局部血管生成因子和抑制因子动态平衡打破。而目前有关slit2基因在脉络膜新生血管形成中所起作用的研究较少,我们前期研究证明RPE细胞中slit2及Robo1均有表达,且沉默slit2后,Robo1及VEGF的表达也随之减少,初步证实了slit2/robo1可能参与CNV的形成。本实验以猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)为研究对象,RF/6A细胞是公认的研究CNV形成的细胞[10, 11]。发现腺病毒介导slit2转染至RPE细胞24、48 h后,RPE细胞中slit2基因均呈过表达状态,将过表达slit2的RPE细胞与RF/6A共培养后,发现其可促进RF/6A的迁移及管腔形成。研究中还发现RPE细胞过表达slit2基因的同时,其VEGF表达量也随之增多,分泌型VEGF蛋白亦随之增加,与我们课题组前期研究结果一致,表明VEGF参与了RPE中slit2基因对RF/6A的作用。Jin等[12]也证明VEGF可促进RF/6A的增殖及管腔形成,其作用机制是通过PI3K/Akt及 MEK/ERK信号通路起作用。因此本实验进一步证实了RPE细胞中的slit2基因参与脉络膜新生血管的形成,从而导致相关疾病的发生。
综上所述,本实验证明过表达slit2的RPE细胞可促进RF/6A细胞的迁移及管腔形成,进而参与了CNV的形成,为其相关疾病提供新的治疗靶点,如湿性老年黄斑变性、病理性脉络膜变性等。但腺病毒介导目前仍局限在实验研究,尚未进入临床试验;除此本实验为体外实验,尚需要进一步完成体内实验的研究加以证明。
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