400016 重庆,重庆医科大学:临床检验诊断学教育部重点实验室
Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostic Medicine of Ministry of Education,School of Laboratory Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing,400016,China
肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是一种常见的条件致病菌，也是引起社区获得性感染的主要病原菌。它通常定植于正常人群的鼻咽部，一般不会引起疾病，但是当机体免疫力低下时，可以导致侵袭性疾病如肺炎，脑膜炎和菌血症[1]。世界卫生组织估算全球每年约160万人死于肺炎链球菌的感染，5岁以下儿童达100万[2]。因此，明确S.pn 的致病机制，对它的预防和治疗都有重要意义。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一个多功能蛋白，它不仅是参与糖酵解的关键酶，也是病原菌的一个重要毒力因子[3, 4]。胞内表达的GAPDH是参与糖酵解的关键酶，催化3-磷酸甘油醛生成1,3-二磷酸甘油酸。表面表达的GAPDH参与了病原菌在宿主内的定植、侵袭过程[5, 6]，通过结合纤溶酶原、纤溶酶、纤连蛋白、补体C1q等，促进S.pn在宿主的定植和侵袭[7, 8, 9, 10]。作为一个重要的毒力因子，GAPDH既可以定位到病原菌表面，也可以分泌到胞外；GAPDH和烯醇化酶(enolase,Eno)、溶血素(pneumolysin,Ply)一样，都属于非经典分泌蛋白，与经典的分泌蛋白不同，它们缺乏N末端分泌信号肽和C末端细胞壁锚定序列LPXTG序列，但都可以定位到细胞表面及分泌到胞外，目前它们的分泌机制还不清楚[11, 12]。文献报道，在大肠杆菌中分子伴侣DnaJ/Dank/GrpE参与了蛋白的分泌过程[13, 14]，但是在革兰阳性菌中目前还少见详细报道。本课题组前期研究中筛选到9个和DnaJ相互作用的蛋白，包括GAPDH。已经证明了DnaJ和Eno、SpxB(丙酮酸氧化酶)、Dank具有相互作用，并且在S.pn D39中DnaJ缺陷后，非经典分泌蛋白Eno的上清表达显著下调，提示其在S.pn 中可能调控了一些非经典分泌蛋白的分泌[15]。对于DnaJ和GAPDH是否具有相互作用以及DnaJ在GAPDH分泌中是否发挥了一定的作用，目前尚不清楚。
要探讨DnaJ是否在GAPDH的分泌过程中发挥作用，首先需确证二者是否在细胞内有相互作用、是间接作用还是直接作用。本研究在获得S.pn GAPDH的重组蛋白后，采用大肠杆菌双杂交、直接结合实验、生物膜层干涉技术(BLI)反复验证GAPDH和DnaJ的相互作用。通过GPPDH的多克隆抗体鉴定其在细菌中的保守性，以期为下一步功能研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物6～8周雌性KM小鼠12只，体质量25 g左右，购买于重庆医科大学实验动物中心，喂养于SPF级实验室。实验动物许可证号为SYXK(渝)2007-0001。
1.2 菌株和质粒肺炎链球菌NCTC7466(D39，血清型2型)购于英国典型菌种保藏中心，TIGR4(血清型4型)购于美国典型微生物菌种保藏中心，CMCC(B)31109(1型血清型)、CMCC(B)31207(6B血清型)、CMCC(B)31614(14血清型)、CMCC(B)31693(19F血清型)、CMCC(B)31759(23F血清型)菌株购于中国医学细菌保藏管理中心，培养于C+Y半合成培养基。原核表达质粒pET-28a(+)，E.coli BL21(DE3)，感受态为本实验室保存。大肠杆菌双杂交系统购于Agilent公司。培养基为LB培养基。
1.3 主要试剂质粒提取试剂盒(Omega)，DNA片段纯化试剂盒(Roche)，细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN)，限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、PrimeStar 高保真DNA 聚合酶(TaKaRa)，T4 连接酶(Promega)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma)，Ni-NTA亲和层析柱(Novagen)，引物合成(生工)，测序(北京华大)，HRP标记的羊抗鼠IgG(中杉金桥)，3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT) (Sigma)，Protease Inhibitor Cocktail为BBI产品。
1.4 目的基因gap扩增根据GenBank中S.pn D39 gap基因序列(Seq:NC_008533.1)设计引物：P1：5′-CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACG-3′，含BamHⅠ酶切位点；P2：5′-CCGCTCGAGTTATTTAGCAATCTTTGCGA-AGTAT-3′，含XhoⅠ酶切位点。S.pn用C+Y半合成培养基培养至D(600)为0.4～0.5，提取基因组DNA，作为模板，PCR扩增gap 基因。扩增体系为：5×PS buffer(含Mg2+)10.0 μL，dNTP(10 mmol/L)4.0 μL，P1、P2(10 pmol/L)各1.0 μL，S.pn D39基因组DNA 2.0 μL，PrimeStar 0.3 μL，ddH2O 31.7 μL。扩增条件：98 ℃变性10 s、52 ℃退火15 s、72 ℃延伸1 min 20 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用DNA片段纯化试剂盒纯化后保存于-20 ℃。
1.5 重组质粒的构建及蛋白诱导表达和纯化gap基因全长片段和质粒pET-28a(+)用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，回收酶切产物进行连接反应。连接产物转化感受态E.coli BL21(DE3)，铺于含50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板。阳性克隆经PCR鉴定正确后，提取质粒进行双酶切鉴定。双酶切鉴定正确的阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序进一步鉴定。
将测序正确的阳性克隆BL21-pET-28a(+)-gap在0.1 mmol/L IPTG、30 ℃、120 r/min的条件下诱导表达GAPDH蛋白15 h，然后通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，纯化步骤参照文献[16]。
1.6 GAPDH多克隆抗体制备多克隆抗体制备及效价测定参照文献[16]，初次免疫GAPDH蛋白为150 μg，完全弗氏佐剂与蛋白溶液按体积1：1比例混合；第二次和第三次免疫GAPDH蛋白均为75 μg，不完全弗氏佐剂与蛋白溶液按体积1：1 比例混合。末次免疫7 d后取鼠尾静脉血，分离血清，ELISA测定效价。
1.7 GAPDH在S.pn中保守性评价7种不同血清型S.pn培养至D(600)=0.5，6 000 r/min离心10 min，收集细菌沉淀和培养上清，进行Western blot检测，一抗为抗GAPDH多克隆(1：5 000稀释)，二抗为HPR标记的山羊抗小鼠IgG(1：5 000稀释)，化学发光检测。
1.8 大肠杆菌双杂交系统体内验证GAPDH和DnaJ的相互作用大肠杆菌双杂交实验主要参照文献[17]。本实验采用新的HIS3-aadA双报告基因。靶质粒pTRG带四环素抗性基因(Tetr)，诱饵质粒pBT带氯霉素抗性基因(Camr)。HIS3编码组氨酸合成途径的一个蛋白，报告菌E.coli XL1-Blue MRF′ Kan由于HisB的缺陷，在HIS3没有激活前，不能和3-AT(组氨酸酶3的竞争性抑制剂)竞争利用培养基中的组氨酸，因此在含有3-AT的平板上不能生长。只有当待检测的两个蛋白相互作用时，可激活HIS3报告基因的转录，才能和3-AT竞争利用培养基中的组氨酸，可以在含有3-AT的平板上生长，继而激活下游的aadA基因(链霉素抗性基因，Strepr)，从而在含有Strep的平板上生长。如果检测蛋白没有相互作用，则只能在非选择平板上生长(含12.5 μg/mL Tet，25 μg/mL Cam)，在3-AT平板(含12.5 μg/mL Tet，25 μg/mL Cam，5 mmol/L 3-AT) 及双选择平板(含12.5 μg/mL Tet，25 μg/mL Cam，5 mmol/L 3-AT，12.5 μg/mL Strep)上均不能生长。
靶质粒构建：以P1、P2为引物，S.pn D39 基因组为模板扩增gap基因，克隆入靶质粒pTRG，转化 E.coli XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞，以Tet抗性的LB平板进行筛选。经PCR、双酶切、DNA测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为pTRG-gap。
将靶质粒和诱饵质粒共转化到E.coli XL1-Blue MRF′Kan感受态细胞中，铺于非选择性平板，用pTRG和pBT通用引物菌液PCR鉴定是否 转入双质粒,扩增体系及引物参照文献[17]。双质粒阳性的菌分别铺于3-AT平板和双选择性平板，37 ℃培养，观察是否生长。
共转化质粒分组：实验组为pTRG-gap和pBT-dnaJ (pBT-dnaJ为本实验室前期构建)；阴性对照组为pTRG和pBT-dnaJ、pTRG-gap和pBT；阳性对照组为pTRG-Gal11p和pBT-LGF2(系统自带)、pTRG-dnaK和pBT-dnaJ(本实验室前期构建)。
1.9 直接结合实验体外验证GAPDH和DnaJ的相互作用直接结合实验可以验证两个蛋白之间是否具有直接的相互作用，基本原理类似ELISA。用pH 9.6 的碳酸钠缓冲液将DnaJ-flag蛋白(重庆泽恒生物技术有限公司表达与纯化)稀释成5 μg/mL，100 μL/孔4 ℃包被过夜，1% BSA作为阴性对照。洗板3次，每孔加入200 μL 5% 脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h；洗板3次，用封 闭液将GAPDH蛋白稀释成不同的浓度(0~200 μg/mL)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗板3次,每孔加入100 μL鼠抗GAPDH多克隆抗体(1：1 000稀释)37 ℃孵育1 h；洗板6次，每孔加入100 μL HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1：5 000稀释)，37 ℃孵育45 min；洗板6次,TMB显色15 min，100 μL/孔2 mol/L H2SO4终止反应后，450 nm测吸光度值。
1.10 BLI验证GAPDH和DnaJ的相互作用BLI的基本原理是生物分子结合到传感器表面会形成一层生物膜，生物膜对透过传感器的光波造成干涉现象，干涉现象以相位移动的方式被检测，从而可以检测到结合到传感器表面分子数量的变化。实验中利用octeRED96分子互作仪对GAPDH和DnaJ的相互作用进行实时监测及动力学参数计算。
配制生物素溶液(10 mmol/L)，按生物素:蛋白(摩尔比)为20：1的比例，加入DnaJ蛋白及生物素溶 液，PBS定容至1 mL，颠倒混匀后，4 ℃静置1 h。采用脱盐柱纯化生物素标记DnaJ蛋白，4 ℃保存备用(纯化后生物素标记DnaJ蛋白浓度为10～15 μg/mL)。用PBS将GAPDH蛋白稀释成4.8、2.4、1.2、0.6 μmol/L，上样200 μL，以PBS为空白对照。利用Fortebio Octet RED96大分子反应分析仪检测。
2 结果 2.1 重组表达质粒pET-28a(+)-gap的构建与鉴定gap基因PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在相对分子量1 008 bp位置有一条特异性条带，与gap基因全长相符(图 1A)。将此基因插入表达质粒pET-28a(+)中，阳性克隆进行PCR鉴定，扩增到1 008 bp 的目的基因(图 1B)。提取质粒进行双酶切也得到相同大小的条带(图 1C)。初步鉴定正确的质粒送华大基因测序，结果与GenBank公布的测序结果一致，证明重组质粒构建成功。
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| A:gap基因扩增M:DL5000DNA标准;1:gap基因扩增产物;B:BL21-pET-28a (+)-gap PCR鉴定M:DL2000标准;1:BL21-pET-28a (+)-gap PCR鉴定产物;C:质粒pET-28a (+)-gap BamHⅠ及XhoⅠ双酶切M:DL2000标准;1:质粒pET-28a (+)-gap BamHⅠ及XhoⅠ双酶切产物 图 1 重组表达质粒pET-28a(+)-gap构建与鉴定 |
由SDS-PAGE可见，与未诱导菌相比，含有表达质粒pET-28a(+)-gap的重组菌E.coli BL21(DE3)经0.1 mmol/L的IPTG诱导后，在相对分子质量约为37×103处有一条明显增粗的蛋白条带(图 2A)。超声破菌后上清经Ni-NTA树脂亲和层析纯化，超滤脱盐后SDS-PAGE分析发现所得重组GAPDH蛋白纯度达90%(图 2B)，可用于后续实验。
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| A：GAPDH诱导表达 M：标准；1：诱导后重组菌；2：未诱导重组菌；B：纯化的GAPDH SDS-PAGE鉴定 1：纯化的GAPDH重组蛋白；M：标准 图 2 SDS-PAGE分析GAPDH重组蛋白的诱导表达及纯度 |
重组GAPDH免疫KM小鼠3次后，分离血清，经间接ELISA法测定效价，结果显示，抗GAPDH多克隆抗体效价可达107。
2.4 GAPDH保守性分析Western blot检测了7种不同血清型S.pn全菌裂解液及培养上清中GAPDH的表达，以重组GAPDH为阳性对照，结果显示在阳性对照处出现一条特异性条带(图 3)，相对分子质量约为37×103，说明抗GAPDH多克隆抗体可以特异性识别GAPDH蛋白。在7种不同血清型S.pn全菌裂解液和培养上清中均检测到了GAPDH的表达，说明GAPDH在S.pn中高度保守表达，同时也显示其具有保守的胞外分泌。
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| x1:GAPDH重组蛋白;2:CMCC (B)31109(1型);3:D39(2型);4:TIGR4(4型);5:CMCC (B)31207(6B型);6:CMCC (B)31614(14型);7:CMCC (B)31693(19F型);8:CMCC (B)31759(23F型) 图 3 Western blot检测GAPDH在S.pn中的保守性 |
靶质粒pTRG-gap经PCR(图 4A)和双酶切鉴定(图 4B)正确,测序结果与GenBank公布的gap序列一致，说明靶质粒构建成功。实验组、阳性对照组和阴性对照组(图 4D)，在非选择平板(图 4E)上均生长，提示双质粒共转化成功，实验组克隆经PCR鉴定证实成功转入双质粒pTRG-Gap和pBT-DnaJ(图 4C)。非选择平板上的实验组及对照组克隆再转种到3-AT平板(图 4F)和双选择平板(图 4G)后，可以看到只有实验组及阳性对照组在3-AT平板和双选择平板生长，而阴性对照组未见生长，说明GAPDH和DnaJ在细胞内可以相互结合。
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| A:靶质粒pTRG-gap PCR扩增M:DL2000标准;1:靶质粒pTRG-gap PCR扩增产物;B:靶质粒pTRG-gap BamHⅠ及XhoⅠ双酶切M:DL2000标准;1:靶质粒pTRG-gap BamHⅠ及XhoⅠ双酶切产物;C:靶质粒pTRG-gap及诱饵质粒pBT-dnaJ共转化E.coli XL1-Blue MRF′ Kan PCR鉴定M:DL2000标准;1:gap扩增产物;2:dnaJ扩增产物;D:平板示意图1:实验组共转化菌;2:系统自带阳性对照共转化菌;3:已知阳性对照共转化菌;4:阴性对照质粒共转化菌;5:阴性对照质粒共转化菌;E:非选择平板(含Tet,Cam);F:3-AT平板(含Tet、Cam、3-AT);G:双选择平板(含Tet、Cam、3-AT、Strep) 图 4 大肠杆菌双杂交验证GAPDH和DnaJ的相互作用 |
以BSA为对照，将恒量的DnaJ和BSA包被于96孔板。把GAPDH看做DnaJ的一抗，按一定的浓度梯度加入96孔板，用抗GAPDH的多克隆抗体检测GAPDH是否和DnaJ有结合，如果有结合，说明DnaJ和GAPDH具有直接的相互作用。结果显示，与BSA对照组相比，随着GAPDH浓度的增加，GAPDH和DnaJ的结合也增加,呈浓度梯度依赖的关系(图 5)。说明GAPDH和DnaJ能够直接相互结合。
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| 图 5 直接结合实验验证GAPDH和DnaJ的相互作用 |
在300 s之前，GAPDH和DnaJ的结合呈浓度梯度依赖的关系，随着GAPDH浓度的增加,二者结合增 加，与直接结合实验结果一致。在300 s之后，开始缓慢解离，最后达到结合解离平衡(图 6)。通过octeRED96 分子互作仪相对应软件计算二者相互作用参数，得出GAPDH和DnaJ相互作用的结合常数达 2.91×103 (mol·s)-1，解离常数达3.25×10-4 s-1，亲和常数达到了1.12×10-7 mol/L，说明二者具有较强的结合力和较高的亲和力，再次证明GAPDH和DnaJ具有直接的相互作用。
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| 图 6 BLI验证GAPDH和DnaJ的相互作用 |
蛋白相互作用的验证是进行其功能研究的基础。我们前期研究显示，DnaJ可能参与GAPDH的非经典分泌[15]，需要确证二者是否有相互作用。目前有多种鉴定蛋白相互作用的方法，包括酵母双杂交系统、细菌双杂交系统、免疫共沉淀、直接结合实验、BLI等，在进行相互作用研究时需要根据实情进行考虑。
酵母双杂交系统是基于真核细胞转录因子的作用原理而建立的[18]。细菌双杂交系统是利用转录激活的原理检测蛋白质之间的相互作用，能在活体内鉴定蛋白质的相互作用，具有高度敏感性，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能检测到的优点。与酵母双杂交相比，细菌的转化效率显著高于酵母细胞，这为更加高通量地筛选文库提供了条件；诱饵和靶蛋白不需要定位信号，避免了酵母内源蛋白所引起的假阳性以及减少了自激活阳性率。细菌双杂交系统的缺点在于缺乏翻译后修饰系统，真核蛋白可能不会被正确的折叠及翻译后修饰[18]。免疫共沉淀是以抗原和抗体之间专一性作用为基础的用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。其优点是相互作用蛋白都是翻译后修饰的，处于天然状态，二者相互作用也是在自然状态下进行，避免了人为的影响。缺点是检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用。对于原核生物来讲，细菌双杂交就不存在翻译后修饰的问题。由于其敏感度高，能较好的反应自然状态下的蛋白结合情况，因此本研究首先采用该方法验证了GAPDH与DnaJ的相互作用。然而，细菌双杂交虽然能够反映蛋白的相互作用，但不能确定二者是否有直接相互作用。而免疫共沉淀也同样具有这个缺点。因此需要选择其他方法验证二者是否有直接相互作用。
直接结合实验和BLI都是活体外验证蛋白相互作用的方法，而BLI还可实时监测蛋白之间的相互作用，同时测定蛋白质之间相互作用的动力学参数。由于活体外实验过程中，蛋白不一定与自然状态相吻合，其结果容易出现假阳性和假阴性。因此，对于活体外的验证实验我们采用了这两种方法，以增加结果的可靠性。实验结果显示，GAPDH与DnaJ在这两种验证方法中都表现出较强的结合，提示二者确实有直接相互作用。
GAPDH作为糖酵解的关键酶，在胞内均保守表达，但是作为一个重要的多功能蛋白，GAPDH发挥其毒力效应的基础是其在病菌的表面定位及胞外分泌[7, 8, 9]。目前对于GAPDH胞外分泌是否保守存在尚无直接证据。本研究验证了GAPDH在国内常见血清型1、2、4、6B、14、19F和23F菌株中均有保守性分泌，为其毒力作用机制研究提供了一定的实验依据。
综上所述，本研究证实了GAPDH在S.pn胞内保守表达、胞外保守性分泌，并证实了GAPDH和热休克蛋白DnaJ具有直接的相互作用，为进一步研究热休克蛋白DnaJ在非经典分泌蛋白GAPDH的分泌及其毒力中所发挥的作用奠定了实验基础。
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