2 646000 泸州，泸州医学院第一附属医院肿瘤科
2 Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan Province, 646000, China
随着肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)理论的深入研究，人们逐渐认识到具有自我更新和无限增殖能力的CSCs才是肿瘤发生及转移的根源。有文献报道，在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌及肺癌等肿瘤中CSCs的侵袭转移能力明显强于普通肿瘤细胞[1, 2, 3]。卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率居第3位，但其死亡率居妇科肿瘤之首，其主要原因是卵巢癌易于扩散转移。目前研究人员已从卵巢癌组织、腹水及细胞株中成功分离出CD133+OCSCs，并证实OCSCs在卵巢癌发生、发展中起关键作用[4, 5, 6]。
以往研究已证实，趋化因子与其受体的在CSCs的侵袭转移中发挥重要作用。如脑胶质瘤干细胞在CXCL12与其受体CXCR4共同作用下参与脑胶质瘤的转移[7]；CXCL8/CXCR1轴被证实在乳腺癌干细胞的侵袭转移中起着重要作用[8]；CXCR4+/CD44+鳞癌干细胞是肿瘤发生转移的启动因素[9]；CXCR4可通过调控EMT促进食管癌的侵袭转移[10]。同时趋化因子也可促进肿瘤细胞生长，如CXCL12/CXCR4信号轴可促进卵巢癌细胞的增殖[11]。
我们前期已从卵巢癌细胞系A2780中成功分离、培养、鉴定出OCSCs[12, 13]。本研究在此基础上，拟通过PCR芯片分析方法检测CD133+OCSCs与CD133-nOCSCs之间趋化因子及趋化因子受体的表达差异，找出维持OCSCs增殖及高侵袭转移能力的关键分子，为卵巢癌临床防治提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 细胞株与试剂
卵巢癌细胞株A2780购自美国典型培养物收藏中心(ATCC)。反转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒购自Takara公司；CXCL16 ELISA检测试剂盒购自上海瑞聪生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购于碧云天公司；纯化CXCL16及CXCR6的中和抗体购自R&D公司；FITC标记的鼠抗人CXCR6单克隆抗体购自Santa Cruz公司；shRNA慢病毒载体购自上海吉凯基 因化学技术有限公司；Transwell小室(滤膜直径8 μm) 购自Millipore公司。 1.2 方法 1.2.1 OCSCs的分离与培养
采用无血清诱导法从卵巢癌A2780细胞中分离出OCSCs，具体分离、培养及鉴定方法见文献[12]。 1.2.2 PCR芯片分析
采用美国SABiosciences公司PAHS-3803E型号芯片，实验结果由上海康成生物工程有限公司提供。 1.2.3 Real-time PCR检测CXCL16和CXCR6表达
提取OCSCs及nOCSCs细胞mRNA后按照Takara反转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒的说明书进行操作，使用ABI 7300 Real-time PCR仪以β-actin基因作为内参进行相对定量检测CXCL16及CXCR6的表达，引物序列见表 1。反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 45 s，40个循环。使用比较△△Ct值方法计算相对基因表达水平。每组设置 3个复孔，实验重复3次。
| 基因名称 | 引物序列(5′→3′) | 产物长 度(bP) |
| β-actin | 上游TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG | 201 |
| 下游GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG | ||
| CXCL16 | 上游CCTTGTCTCTTGCGTTCTTCC | 139 |
| 下游TCCAAAGTACCCTGCGGTATC | ||
| CXCR6 | 上游GCTCATCTCTGGAACAAACTG | 131 |
| 下游TGCTGAACTGCAGGAAGTC |
将细胞密度调整至1×105/mL取1 mL OCSCs和nOCSCs分别培养24 h后收集上清，并储存于-20 ℃备用。按照ELISA试剂盒说明书操作检测CXCL16的浓度，使用Bio-Rad公司酶标仪测定D(450)值。实验重复3次。 1.2.5 流式细胞仪检测CXCR6的表达
将OCSCs及nOCSCs吹打制成单细胞悬液，并调整至1×105/mL，取1 mL细胞离心后加入预冷的100 μL PBS重悬细胞。然后加入 FITC标记的鼠抗人CXCR6单克隆抗体1 μL，37 ℃孵育30 min。预冷的PBS洗涤细胞2次，1%多聚甲醛液固定。采用流式细胞仪检测每组细胞CXCR6表达率。实验重复3次。 1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖
将OCSCs计数并稀释至2×104/mL，取100 μL细胞/孔接种于96孔板，实验组加入CXCL16 中和抗体(30 ng/mL)，对照组加入PBS。置于37 ℃、5% CO2孵箱中。按照CCK-8试剂盒说明书分别于第0、1、2、3、4天以酶标仪测量D(450)值。每组设置5个复孔，实验重复3次。 1.2.7 慢病毒转染
取密度为2×105/mL的OCSCs 接种在24孔板中，实验组加入10 μL密度为2×108/mL 的CXCL16-shRNA病毒(shRNA序列5′-CAUGA-AUCGUCUCCGGAAACATT-3′)，对照组加入10 μL密度为2×108/mL的对照shRNA病毒(shRNA序列5′-AGGUAGUGUAAUCGCCUUGTT-3′)。细胞置于37 ℃，5%CO2孵箱培养，24 h后更换为新鲜培养基。采用荧光显微镜及流式细胞仪检测慢病毒转染效率，ELISA检测CXCL16基因沉默效率。转染成功的细胞用于后续Transwell迁移及侵袭实验。 1.2.8 Transwell迁移实验阻断实验
将OCSCs计数并稀释为1×105/mL，取200 μL加入上室，下室中加入含10％FBS的培养基800 μL。CXCL16中和抗体组上室中加入CXCL16 中和抗体(30 ng/mL)，CXCR6中和抗体组上室中加入CXCR6中和抗体(10 ng/mL)，对照组上室中加入PBS。shRNA沉默实验：将转染成功的OCSCs计数并稀释为1×105mL，实验组上室加入200 μL转染CXCL16-shRNA的OCSCs，对照组上室加入200 μL含2×104个转染对照shRNA的OCSCs，下室中加入含10％FBS的培养基800 μL。于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育24 h。棉棒拭去上室细胞，95%的乙醇固定20 min，1%的结晶紫染色3 min，在显微镜下观察并照相，每组随机选取10个200倍视野计数取平均值，以穿膜细胞数的多少表示细胞迁移能力。每组设置3个复孔，实验重复3次。 1.2.9 Transwell侵袭实验
将4 ℃预冷过夜的基质胶与培养液按照1 ∶2的比例进行稀释，以30 μL/孔的量加入上室，37 ℃孵育2 h。将OCSCs计数并稀释至2×105/mL，上室中加入200 μL细胞，其余实验分组及实验步骤同Transwell迁移实验。每组设置3个复孔，实验重复3次。 1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件，数据以x±s表示，2组样本的均数比较采用配对t检验。 2 结果 2.1 OCSCs和nOCSCs中CXCL16及CXCR6的表达
通过对PCR芯片分析结果中OCSCs与nOCSCs在mRNA水平表达差异大于3倍的趋化因子及趋化因子受体进行分析，我们发现OCSCs不仅高表达CXCL16，同时高表达其唯一受体CXCR6(表 2)。采用Real-time PCR验证发现OCSCs的CXCL16 mRNA表达水平是nOCSCs的(4.59±0.73)倍(P<0.01)，CXCR6 mRNA表达水平是nOCSCs的(18.24±0.77)倍 (P<0.01)，这与PCR芯片分析结果相符。ELISA结 果显示OCSCs的CXCL16分泌量远远高于nOCSCs的 分泌量 [(2 434.00±204.65) vs (129.33±31.64)ng/mL,P<0.01]。流式细胞仪检测发现OCSCs表面CXCR6表达率显著高于nOCSCs(60.6% vs 2.4%,P<0.01)。上述结果说明OCSCs自分泌高水平的CXCL16且高表达其受体CXCR6。
趋化因子 | nOCSCs | OCSCs | 趋化因 子受体 | nOCSCs | OCSCs |
| CXCL14 | 1 | 3.37 | CCRL1 | 1 | 3.16 |
| CCL3L1 | 1 | 3.41 | CCR7 | 1 | 7.12 |
| CXCL16 | 1 | 3.41 | CCR3 | 1 | 8.06 |
| CCL7 | 1 | 3.62 | CXCR6 | 1 | 12.89 |
| CCL2 | 1 | 5.04 | CCR1 | 1 | 20.46 |
| CCL27 | 1 | 6.24 | CCRL2 | 1 | 28.98 |
| CCL5 | 1 | 9.70 | |||
| CXCL10 | 1 | 13.96 |
CCK-8结果显示，与对照组比较，当中和抗体阻断CXCL16后，OCSCs的增殖能力在4 d内无明显差异(P>0.05,表 3)。
组别 | 0 d | 1 d | 2 d | 3 d | 4 d |
| 对照组 | 0.26±0.02 | 0.42±0.03 | 0.68±0.01 | 1.12±0.04 | 1.51±0.08 |
| CXCL16中 和抗体组 | 0.27±0.01 | 0.44±0.02 | 0.62±0.05 | 1.08±0.07 | 1.47±0.05 |
Transwell实验结果显示，CXCL16中和抗体组相 比对照组迁移细胞数显著降低(21.33±3.06 vs 43.00± 4.00，P<0.01)，CXCL16中和抗体组相比对照组侵袭细胞数同样显著降低(18.00±4.00 vs 44.58±4.51，P<0.01，图 1)。
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| 图 1 Transwell实验检测中和抗体阻断CXCL16对OCSCs 侵袭迁移能力的影响(结晶紫 ×200) |
用荧光显微镜观察转染后的细胞，发现CXCL16-shRNA组及对照shRNA组均获得了良好的转染率(图 2)，流式细胞仪检测发现CXCL16-shRNA组转染效率为86.3％，对照shRNA组的转染效率为92.1％。 ELISA检测转染后细胞分泌CXCL16的能力，结果显示CXCL16-shRNA组细胞分泌水平较对照shRNA组显著降低[(495.45±37.59) vs(2 463.32±149.14)ng/mL,P<0.01]。成功转染CXCL16-shRNA的OCSCs可用于后续实验。Transwell实验结果显示，与对照shRNA组比较，CXCL16-shRNA组迁移细胞数显著降低(28.00±3.00 vs 59.33±2.52，P<0.01)。与对照shRNA组相比，CXCL16-shRNA组侵袭细胞数同样 显著降低(28.67±4.04 vs 63.67±3.51,P<0.01，图 3)。
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| 图 2 慢病毒转染OCSCs的效率(×100) |
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| 图 3 Transwell实验检测shRNA沉默CXCL16对OCSCs侵袭迁移能力的影响(结晶紫 ×200) |
Transwell实验结果显示，CXCR6中和抗体组和对照组比较，迁移细胞数显著降低(33.17±5.03 vs 64.67±4.16，P<0.01)。相对于对照组，CXCR6中和抗体组侵袭细胞数同样显著降低(24.33±4.04 vs 55.67±3.51，P<0.01，图 4)。
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| 图 4 Transwell实验检测中和抗体阻断CXCR6对OCSCs侵袭迁移能力的影响 (结晶紫 ×200) |
肿瘤组织中的趋化因子及受体为肿瘤细胞增殖、黏附及定向迁移提供条件，与肿瘤发展及转移密切相关[14]。人胶质瘤、结肠癌、前列腺癌等肿瘤组织高表达趋化因子CXCL16。研究发现前列腺癌细胞可分泌CXCL16与CXCR6相结合，进而促进其增殖及侵袭转移能力[15]。但目前CXCL16对肿瘤干细胞生物学特性的影响还不清楚。
我们通过PCR芯片分析检测发现，与nOCSCs相比，OCSCs不仅分泌大量CXCL16，同时还高表达其唯一受体CXCR6，这提示OCSCs可能通过自分泌CXCL16途径影响其生物学特性。我们用CCK-8法检测发现阻断CXCL16对OCSCs的增殖能力几乎没有影响，说明CXCL16不参与OCSCs的自我更新。既往文献报道IL-8在结肠癌干细胞的自我更新及成瘤中起重要作用[16]。IL-6受体被阻断后可以抑制肺癌干细胞的增殖[17]。下一步我们将结合PCR芯片分析结果继续探索维持OCSCs自我更新的关键因子。本实验中分别采用中和抗体和shRNA干扰阻断了CXCL16，用Transwell实验检测发现OCSCs的侵袭迁移能力受到明显抑制，说明CXCL16在维持OCSCs高侵袭迁移能力中起重要作用。同时我们发现中和抗体阻断OCSCs表面的CXCR6后，OCSCs的侵袭迁移能力同样受到明显抑制。这些结果提示OCSCs自分泌CXCL16并通过与其表面的受体CXCR6结合，进而维持OCSCs的高侵袭迁移能力。已有文献报道CXCL16能够直接活化NF-κB信号通路从而诱导细胞增殖、促血管生成[18]，同时CXCL16可通过NF-κB信号通路，促进肝癌细胞的侵袭转移[19]。以上研究结果提示CXCL16可能通过NF-κB信号通路维持OCSCs高侵袭迁移能力。
综上所述，我们在体外证实了OCSCs自分泌CXCL16并通过结合CXCR6维持自身的高侵袭迁移能力。后续研究中我们将用动物实验体内验证这一发现，并通过NF-κB信号通路阻断等方法对其机制进行深入研究。本研究从自分泌角度阐明了趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在维持OCSCs高侵袭迁移中的作用，为卵巢癌的临床防治提供了新思路。
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