胰腺癌(Pancreatic cancer)是一种侵袭性、致死性极强的消化道恶性肿瘤[1]。目前全世界每年约有330 300人死于该疾病[2],居恶性肿瘤死亡原因的第4位[3]。胰腺癌起病隐匿,早期诊断困难,进展迅速,早期便可发生邻近脏器的侵犯及远处转移,具有极为恶性的生物学特征[4]。近年来,尽管胰腺癌的诊断技术和治疗方法有所改进,但患者的预后并未发生明显改善,其中位生存时间仍不足6个月[5],而5年生存率仅为6%[3]。
硫酸软骨素蛋白多糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4,CSPG4),又名NG2,是一种系统发育中高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白[6, 7]。研究表明,CSPG4异常高表达于人类黑色素瘤中,可促进肿瘤细胞的生长、黏附、运动和侵袭等恶性生物学行为[7],并参与新生血管形成[8]。之前虽已有报道证实胰腺癌中存在CSPG4的表达[6],但其表达的临床意义及其与胰腺癌发生、发展的关系目前尚不清楚。本研究检测胰腺导管腺癌和正常胰腺组织中CSPG4的表达,结合患者临床资料,分析CSPG4的表达与胰腺癌患者临床病理特征的相关性,探讨其对患者预后的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 患者资料
收集2007年6月至2010年 6月于我科手术切除并经病理检查确诊的胰腺导管腺癌及正常胰腺组织(距肿瘤边缘>2 cm)标本各 160例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或免疫治 疗,且临床病理资料完整。 其中男性124例,女性36例;年龄33~75(56.98±10.75)岁,胰头癌142例,胰体尾癌18例;肿瘤大小:直径≤2 cm 62例,>2 cm 98例;分化程度:高分化18例,中分化100例,低分化42例;浸润深度:T1~T2期92例,T3~T4期68例;有淋巴结转移50例,无淋巴结转移110例;有血管侵犯38例,无血管侵犯122例;按美国癌症联合委员会(AJCC) 胰腺癌TNM分期标准(2010版):Ⅰ期74例,Ⅱ~Ⅲ期86例。所有患者均签署知情同意书。 1.1.2 主要试剂
兔抗人NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan多克隆抗体购自美国Millipore公司;EnVisionTM二抗显色试剂盒购自美国Dako公司;山羊血清购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 免疫组织化学染色
采用EnVisionTM二步法,所有标本经固定、包埋后,行4 μm连续切片。经常规脱蜡、水化后,3%过氧化氢37 ℃孵育30 min,枸橼酸钠(0.01 mol/L,pH=6.0)抗原修复(120 ℃,3 min);10%山羊血清封闭后(37 ℃,30 min),滴加1 ∶150 兔抗人CSPG4一抗,4 ℃孵育过夜。次日滴加EnVisionTM抗鼠/兔通用型二抗,37 ℃孵育60 min;DAB显色,苏木精复染后,脱水、透明,中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照。 1.2.2 免疫组化染色结果评价
2位研究者采用双盲法对染色结果进行独立观察评价。结果判定采用半定量法,根据显微镜下染色强度进行分类:细胞未着色记为阴性(-);淡黄色记为弱阳性(+);棕黄色记为阳性(+ +);棕褐色记为强阳性(+ + +)。 为便于统计分析,将(-)定义为阴性表达;(+)、(+ +)、(+ + +) 定义为阳性表达。 1.2.3 随访
160例患者中失访2例、围手术期死亡4例,余154例纳入随访。采用电话或门诊随访的方式,自手术之日起每3个月随访1次直至患者死亡或2013年6月30日。总生存时间定义为自手术之日起至出现与胰腺癌相关的死亡的时间。死于其他原因或在随访期内生存的病例作为截尾事件处理。全部患者随访2~54个月,中位随访时间14个月。 1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件。采用χ2检验比较胰腺癌与癌旁正常胰腺组织中CSPG4的表达差异,并分析胰腺癌中CSPG4的表达与其临床病理参数的关系,实验数据以百分比形式表示;应用Kaplan-Meier曲线分析胰腺癌中CSPG4的表达与患者术后生存的关系,并进行log-rank检验,实验数据以x±s形式表示;运用Cox风险回归模型进行单因素、多因素分析胰腺癌患者预后的影响因素。 2 结果 2.1 CSPG4在胰腺导管腺癌及正常胰腺组织中的表达
160例胰腺导管腺癌组织中,CSPG4阴性表达86例,阳性74例,阳性率46.25%,且阳性染色主要位于肿瘤细胞的细胞膜及细胞质(细胞质为主),多呈灶状分布,以棕黄色或棕褐色着色为主;160例正常胰腺组织中,CSPG4阴性表达144例,阳性16例,阳性率10.00%,且阳性染色主要位于腺泡细胞及导管上皮细胞的细胞膜及细胞质(细胞质为主),多呈弥漫分布,以淡黄色着色为主(图 1)。胰腺癌组织中CSPG4阳性表达率显著高于正常胰腺组织,且差异具有显著性(χ2=52.004,P<0.01)。
2.2 CSPG4表达与胰腺癌患者临床病理参数的关系160例胰腺癌组织中,CSPG4的表达与有无淋巴结转移或血管侵犯、肿瘤T分期、TNM分期显著相关(P<0.01);而与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位及分化程度无明显相关(P>0.05,表 1)。
临床病 理参数 |
n | CSPG4的表达 | χ2 | P | |
阴性(n=86) | 阳性(n=74) | ||||
年龄 | |||||
≤65岁 | 118 | 58(49.15) | 60(50.85) | 3.822 | >0.05 |
>65岁 | 42 | 28(66.67) | 14(33.33) | ||
性别 | |||||
男 | 124 | 64(51.61) | 60(48.39) | 1.013 | >0.05 |
女 | 36 | 22(61.11) | 14(38.89) | ||
肿瘤直径 | |||||
≤2 cm | 62 | 38(61.29) | 24(38.71) | 2.315 | >0.05 |
>2 cm | 98 | 48(48.98) | 50(51.02) | ||
肿瘤部位 | |||||
胰头 | 142 | 80(56.34) | 62(43.66) | 3.401 | >0.05 |
胰体尾 | 18 | 6(33.33) | 12(66.67) | ||
分化程度 | |||||
高分化 | 18 | 10(55.56) | 8(44.44) | 0.862 | >0.05 |
中分化 | 100 | 56(56.00) | 44(44.00) | ||
低分化 | 42 | 20(47.62) | 22(52.38) | ||
淋巴结转移 | |||||
无 | 110 | 68(61.82) | 42(38.18) | 9.217 | <0.01 |
有 | 50 | 18(36.00) | 32(64.00) | ||
血管侵犯 | |||||
无 | 122 | 74(60.66) | 48(39.34) | 9.854 | <0.01 |
有 | 38 | 12(31.58) | 26(68.42) | ||
T分期 | |||||
T1~T2期 | 92 | 62(67.39) | 30(32.61) | 16.204 | <0.01 |
T3~T4期 | 68 | 24(35.29) | 44(64.71) | ||
TNM分期 | |||||
Ⅰ期 | 74 | 54(72.97) | 20(27.03) | 20.465 | <0.01 |
Ⅱ~Ⅲ期 | 86 | 32(37.21) | 54(62.79) |
Kaplan-Meier生存分析显示胰腺癌组织中CSPG4阴性表达者术后平均生存时间明显高于CSPG4阳性表达者[(21.85±12.16) vs (8.94±4.97)个月],且差异具有显著性(P<0.01,图 2)。
胰腺癌组织中CSPG4阴性表达者1年生存率(75.60% vs 20.70%)、2年生存率(34.50% vs 0)、3年生存率(17.40% vs 0)及中位生存时间(20个月 vs 9个月)明显高于CSPG4阳性表达者,且差异具有显著性(P<0.01)。 2.4 胰腺癌患者预后的影响因素
应用Cox比例风险回归模型进行单因素预后分析,结果显示CSPG4表达(P<0.01)、有无血管侵犯(P<0.01)或淋巴结转移(P<0.01)、肿瘤部位(P<0.05)、分化程度(P<0.05)、T分期(P<0.01)及TNM分期(P<0.01)均是胰腺癌患者预后的影响因素;而患者年龄、性别及肿瘤直径均不是胰腺癌患者预后的影响因素(P>0.05)。将单因素分析结果中影响患者预后的因素全部纳入Cox比例风险回归模型,进行多因素预后分析,结果显示CSPG4表达(P<0.01)、有无淋巴结转移(P<0.01)及肿瘤分化程度(P<0.05)是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素(表 2)。
变量 | n | 单因素分析 | 多因素分析 | ||
死亡危险比(95%CI) | P | 死亡危险比(95%CI) | P | ||
年龄 | |||||
≤65岁 | 112 | 1.0 | >0.05 | — | — |
>65岁 | 42 | 0.832(0.569~1.218) | — | ||
性别 | |||||
男 | 120 | 1.0 | >0.05 | — | — |
女 | 34 | 1.018(0.685~1.513) | — | ||
肿瘤直径 | |||||
≤2 cm | 60 | 1.0 | >0.05 | — | — |
>2 cm | 94 | 1.191(0.845~1.678) | — | ||
肿瘤部位 | |||||
胰头 | 136 | 1.0 | <0.05 | 1.0 | >0.05 |
胰体尾 | 18 | 1.864(1.089~3.190) | 1.622(0.919~2.862) | ||
分化程度 | |||||
高分化 | 18 | 1.0 | 1.0 | ||
中分化 | 96 | 2.157(1.205~3.862) | <0.05 | 2.158(1.161~4.012) | <0.05 |
低分化 | 40 | 2.372(1.243~4.526) | <0.01 | 2.410(1.236~4.698) | <0.05 |
淋巴结转移 | |||||
无 | 106 | 1.0 | <0.01 | 1.0 | <0.01 |
有 | 48 | 2.392(1.651~3.464) | 2.258(1.350~3.778) | ||
血管侵犯 | |||||
无 | 116 | 1.0 | <0.01 | 1.0 | >0.05 |
有 | 38 | 2.129(1.449~3.126) | 1.134(0.675~1.906) | ||
T分期 | |||||
T1~T2期 | 86 | 1.0 | <0.01 | 1.0 | >0.05 |
T3~T4期 | 68 | 1.807(1.288~2.534) | 1.800(0.857~3.781) | ||
TNM分期 | |||||
Ⅰ期 | 70 | 1.0 | <0.01 | 1.0 | >0.05 |
Ⅱ~Ⅲ期 | 84 | 1.987(1.406~2.807) | 0.454(0.200~1.033) | ||
CSPG4表达 | |||||
阴性 | 82 | 1.0 | <0.01 | 1.0 | <0.01 |
阳性 | 72 | 4.949(3.331~7.352) | 4.477(2.920~6.864) |
CSPG4由15号染色体上的cspg4基因编码[9],是一种表达于人体内多种细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白[7]。 CSPG4由1个核心蛋白和硫酸软骨素侧链构成[10]。20世纪70年代末,CSPG4最早被发现表达于人类黑色素瘤细胞表面[11],同期研究者发现鼠类中存在其同源蛋白—神经/胶质抗原2(NG2)[12],且两者均在系统发育中高度保守[6, 7]。
CSPG4在人体正常组织中表达量低且分布局限[6],主要存在于血管周细胞及多能干细胞或祖细胞(间充质干细胞、造血干细胞等)表面,可参与血管生成,并调节干细胞或祖细胞的分化、干性维持及自我更新[7, 8]。CSPG4阳性的多能干细胞或祖细胞在终末分化阶段停止表达该蛋白,而在多种肿瘤中却出现了CSPG4的异常高表达,包括黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤及儿童急性白血病等[7],且CSPG4主要分布于肿瘤微环境中的血管周细胞、肿瘤干细胞或祖细胞以及某些其他的肿瘤细胞表面[6]。CSPG4可促进黑色素瘤细胞的增殖、黏附、运动、生存、化疗抵抗及上皮-间质转化(EMT)等恶性生物学行为,进而促进肿瘤的恶性进展[7, 13]。
本研究显示,胰腺导管腺癌中CSPG4阳性表达率显著高于正常胰腺组织(P<0.01);CSPG4的表达与有无淋巴结转移或血管侵犯、肿瘤T分期、TNM分期显著相关(P<0.01)。提示CSPG4可能参与胰腺癌的发生、发展,与胰腺癌的恶性进展程度密切相关。胰腺癌中CSPG4阴性患者术后总生存率显著高于阳性者(P<0.01);且该蛋白的表达是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素。提示胰腺癌中CSPG4的表达对患者术后生存具有重要的评估作用,并可能成为判断胰腺癌患者预后的独立预测指标。Hsu等[14]在乳腺癌中的研究表明,CSPG4高表达患者术后总生存时间及无瘤生存时间显著低于阴性或低表达者,且CSPG4的高表达是乳腺癌患者预后的独立影响因素,这与我们的研究结果相似。
CSPG4促进肿瘤恶性进展的机制尚不完全清楚,有研究证实它可与PDGFAA、(bFGF)、MMP、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白等结合,调节整联蛋白和受体酪氨酸激酶(RTK)等生长因子受体的活性,进而促进FAK、PI3K/AKT和ERK1,2等与肿瘤细胞黏附、生长、运动及生存相关的信号通路的激活[6, 7]。因此,CSPG4可能通过上述机制促进胰腺癌细胞的增殖、黏附、侵袭、转移等恶性生物学行为,在胰腺癌的发生及恶性进展中发挥重要作用,从而影响患者的生存及预后。至于该蛋白与肿瘤恶性进展相关的其他机制还有待于进一步研究。
胰腺癌对放化疗均不敏感,手术切除是目前唯一有效的治疗方法;但大多数患者确诊时已属中晚期而丧失根治性手术切除的时机,手术切除率低(不足20%),因此迫切需要探寻一种新的胰腺癌治疗方法[15, 16]。研究证实,CSPG4已作为治疗靶点而被应用于黑色素瘤[17]、乳腺癌[18]及恶性间皮瘤[19]的靶向治疗,并取得一定的疗效。针对该蛋白的特异性单克隆抗体可阻滞肿瘤细胞中与生长、黏附、运动及生存相关的信号通路[6],抑制肿瘤的进展、复发、转移[7]及新生血管形成[20],从而延长患者的生存时间[21]。另外,针对该靶点的靶向治疗尚未发现明显的毒副作用[7]。因此,CSPG4在胰腺癌的治疗方面具有广阔的应用前景,有望成为胰腺癌靶向治疗的新靶点。
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