严重烧伤后，在毛细血管通透性增加、血容量显著下降之前(一般为伤后6～8 h)，心肌即可发生器质性损害，包括结构损害和功能下降。由于心脏是循环动力器官，早期发生的结构和功能损害势必促成烧伤休克的发生与发展，成为烧伤后早期缺血缺氧的重要启动因素之一[1]，烧伤后防治心肌损害在烧伤救治过程中具有重要意义。近年研究表明在局部缺氧的心肌组织应用干细胞可以有效改善损伤心肌细胞的活力，修复损伤的心肌组织，部分改善心脏功能[2]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有低免疫源性、多向分化功能，同时具有来源广泛，易于体外分离和扩增的特点，为严重烧伤治疗提供了新的治疗措施。研究发现经尾静脉将脂肪间充质干细胞(ADSC)注射到烧伤脓毒症小鼠体内，可降低血肌酐和尿素氮水平，促进抗炎因子IL-10、COX2生成，抑制促炎因子TNF-α、IL-12释放，对烧伤脓毒症小鼠肾脏损伤有保护作用[3]。而MSCs迁移是移植治疗的关键，体外移植的MSCs定向迁移到受损组织,通过分化为特定的细胞、调节微环境，才能实现组织修复、愈合、再生。研究发现在骨再生支架中，基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor 1 alpha，SDF-1α)可通过激活磷脂酰肌3-激酶信号通路(phosphoinositide 3-kinase，PI3K/Akt)促进MSCs迁移[4, 5]。PI3K/Akt通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，可被多种细胞因子和理化因素激活，具有调控物质代谢、基因表达、细胞迁移、增殖和存活等多种生物学功能。PI3K/Akt信号通路是否在严重烧伤微环境介导MSCs迁移，目前尚不清楚。本研究拟采用严重烧伤早期大鼠血清培养BMSCs细胞，观察其对BMSCs细胞迁移的影响，初步探讨PI3K/Akt通路在此过程中的作用，以期为临床移植BMSCs治疗严重烧伤早期心肌损害奠定理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料及仪器SD大鼠BMSCs细胞株及BMSCs完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS，Gibco,USA)，p38、Akt单克隆抗体(Abcam,USA)，磷酸化p38(p-p38)和磷酸化Akt(p-Akt)单克隆抗体(Cell Signaling,USA)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(Proteintech,USA)，LY294002(Santa Cruz,USA)，IGF-1(Prospecbio,Isreal)，Transwell小室(Greiner bio-one,Germany)，HEPA Class 100型CO2孵箱(Thermo,USA)，Fusion FX7凝胶成像分析系统(VILBER lour MAT,French)。
1.2 严重烧伤大鼠血清的制备体质量200～280 g的雄性SD大鼠30只(第三军医大学实验动物中心提供)，参考文献[6]，制成40% TBSA的Ⅲ度烫伤模型。伤后6 h在无菌操作下抽取腹主动脉血，室温凝血，4 ℃过夜，使血凝块尽量收缩。吸出血清，4 ℃离心(3 000 r/min)15 min，取上清，56 ℃ 加热30 min 以灭活补体。上清分装，-20 ℃冻存备用。
1.3 烧伤血清刺激下BMSCs细胞迁移能力检测利用Transwell小室构建BMSCs细胞体外迁移模型，24孔板下室放置0.6 mL含体积分数10%烧伤血清的BMSCs细胞培养基，小室上室接种0.4 mL 1×105/mL的BMSCs细胞，放入 37 ℃、5% CO2培养箱继续培养。分别于0、1、3、6、12、24 h时，取出Transwell小室，将上室培养基吸尽，用棉签擦拭上室中的细胞，PBS漂洗一次，并将小室置于4%多聚甲醛中室温固定20 min，PBS漂洗一次，将小室自然晾干后，5%结晶紫染色30 min，PBS清洗，显微镜下观察、计数迁移到小室膜下表面的BMSCs细胞，每组按照上下左右中随机选取5个视野，取5个视野细胞总数的均数进行统计分析，以迁移至膜下表面细胞个数的均数表示细胞的迁移能力，每个时间点5个复孔。
1.4 Western blot检测烧伤血清刺激下BMSCs细胞的p-p38、p-Akt蛋白表达用含体积分数10%烧伤血清的BMSCs细胞培养基刺激BMSCs细胞，设刺激0(加入烧伤血清后即刻)、1、3、6、12、24 h 6个时间点。收集各时间点细胞进行离心沉淀，按蛋白提取试剂盒说明书提供的方法提取细胞蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg/孔蛋白进行10% SDS-PAGE，转膜后经5% BSA室温封闭2 h，分别加入兔抗大鼠Akt抗体(1 ∶500)、p38抗体(1 ∶2 000)、p-Akt抗体(1 ∶500)、p-p38 抗体(1 ∶500)，4 ℃过夜；次日，TBST洗膜3次，加入1 ∶4 000稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，增强型化学发光试剂显影，获取图像，Fusion FX7凝胶成像分析系统进行灰度分析，结果以p-Akt与Akt、p-p38与p38灰度值比值表示。实验重复3次。
> 1.5 Transwell检测LY294002、IGF-1作用后BMSCs细胞迁移能力取第3代生长状态良好BMSCs，实验随机分为4组：对照组、烧伤血清组、烧伤血清+抑制剂组、烧伤血清+激动剂组。对照组：24孔板下室放置0.6 mL含10% FBS的BMSCs培养基，小室上室接种0.4 mL 1×105/mL的BMSCs细胞；烧伤血清组：24孔板下室放置0.6 mL含体积分数10%烧伤血清的BMSCs细胞培养基，小室上室接种0.4 mL 1×105/mL的BMSCs细胞；烧伤血清+抑制剂组：在上室加入终浓度10 μmol/L 的PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002，余同烧伤血清组；烧伤血清+激动剂组：在上室加入终浓度200 ng/mL的PI3K/Akt信号通路激动剂IGF-1，余同烧伤血清组，培养24 h。处理方法同1.3。
1.6 统计学分析计量数据以 ±s表示，采用SPSS 17.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较行LSD-t检验。
2 结果 2.1 烧伤血清刺激下BMSCs细胞迁移能力检测烧伤血清作用0、1、3、6、12、24 h时，BMSCs细胞迁移数量分别为0、1.0±0.7、14.6±4.6、45.0±6.4、82.8±8.3、122.2±11.4，3 h时BMSCs细胞开始出现迁移，6、12、24 h时BMSCs细胞数量多于3 h(P < 0.01)。见图 1。
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| A～F：分别为作用0、1、3、6、12、24 h 图 1 不同时相点BMSCs细胞的迁移情况(结晶紫染色×100) |
烧伤血清作用0、1、3、6、12、24 h时，BMSCs细胞p-p38水平分别为1.02±0.50、1.11±0.17、1.04±0.23、1.02±0.20、1.16±0.22、1.00±0.19，p-p38蛋白表达在各时间点(1、3、6、12、24 h)变化趋势不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；而p-Akt水平分别为0.59±0.08、0.65±0.06、0.83±0.22、1.10±0.21、1.22±0.19、1.62±0.30，6、12、24 h时较作用0 h时水平明显增高(P < 0.05)；烧伤血清作用3 h时，BMSCs细胞中p-Akt蛋白表达开始升高，12、24 h时较3 h时明显增高(P < 0.05)，见图 2。
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| 1~6：分别为作用0、1、3、6、12、24 h 图 2 烧伤血清作用不同时相点BMSCs细胞p-p38(A)、p-Akt(B)蛋白表达 |
对照组、烧伤血清组、烧伤血清+激动剂组、烧伤血清+抑制剂组培养24 h后，每100倍视野下BMSCs 细胞迁移数量分别是81.0±8.3、109.0±10.9、152.0±11.7、52.6± 8.3，烧伤血清组BMSCs细胞迁移数量较对照组增多 (P < 0.01)，与烧伤血清组比较，烧伤血清+ 激动剂组BMSCs细胞迁移数量增多(P < 0.01)，烧伤血清+抑制剂组细胞迁移数量明显减少(P < 0.01，图 3)。
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| A：烧伤血清+激动剂组；B：烧伤血清+抑制剂组；C：烧伤血清组；D：对照组 图 3 PI3K/Akt信号通路对BMSCs细胞迁移的影响(结晶紫染色×100) |
严重烧伤后患者各器官组织都存在不同程度的损伤。研究表明，烧伤早期心肌组织即可出现严重的缺血、缺氧损害，导致心功能障碍，加重烧伤休克，乃至引发多器官功能障碍综合征(MODS)。因此，烧伤早期给予积极有效的心肌保护措施，以减轻烧伤后心肌的损害，保护心脏功能，减轻组织器官缺血、缺氧损害，维护器官功能具有重要的意义。干细胞移植治疗是一种新的治疗方法。研究发现人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)能促进放射性烧伤患者功能恢复，且目前MSCs已成为治疗放射性烧伤有效治疗方法[7, 8]。目前研究发现hUC-MSCs移植后，能向损伤创面迁移且主要分布于创缘及基底，促进创面愈合，但是hUC-MSCs损伤创面定向迁移机制尚不完全清楚。大量研究表明移植MSCs还能治疗心肌梗死区[9]、大脑局部缺血区[10]、肢体局部缺血灶[11]等病变部位，而MSCs体内靶向迁移是达到临床治疗的高效性和安全性的关键。
研究发现细胞因子、趋化因子等可促进MSCs迁移到损伤部位，进而促进损伤组织、器官修复[12]。在细胞治疗研究中，通过PI3K/Akt信号通路激活剂以及高表达PI3K/Akt，可增加MSCs治疗效能，促进心肌梗死细胞修复[13, 14]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，根据结构和底物的不同可以分为三型，其中Ⅰ型PI3K参与生长因子和细胞因子激活的信号通路应答，主要介导细胞的生存、增殖、分化等生物学功能[15]。严重烧伤后，p38激酶抑制剂SB203580能降低心肌细胞TNF-α分泌，减轻心肌细胞损伤，抑制烧伤引起的心功能不全，p38激酶途径被激活是烧伤后心肌细胞损伤和心功能不全的重要发病机制之一[16]。而研究发现严重烧伤早期心肌细胞激活的PI3K/Akt途径，可抑制缺血缺氧心肌细胞凋亡[17]。烧伤大鼠血清可有效促进大鼠MSCs增殖并能促进其向血管内皮细胞和表皮细胞分化[18]。将MSCs细胞移植治疗严重烧伤，p38和PI3K/Akt这2条信号通路是否也介导其生存及损伤组织归巢，值得探讨。
本研究结果显示，体积分数10%烧伤血清作用BMSCs细胞不同时间后，在一定时间范围内，随着作用时间延长，BMSCs细胞迁移数量增加，且BMSCs细胞p-Akt水平增高，在各时间点表达量有所差异；虽然烧伤血清可激活p38信号通路，但各时间点p-p38变化不明显。BMSCs细胞迁移和PI3K/Akt信号通路的变化趋势提示：BMSCs细胞迁移与PI3K/Akt通路可能存在一定关联。为此，本研究分析PI3K/Akt通路抑制剂和激动剂作用下，BMSCs细胞迁移能力变化，结果显示，在激动剂IGF-1作用下，BMSCs细胞迁移能力增强，而加入抑制剂LY290042后，BMSCs细胞迁移能力明显受抑。进一步说明，在严重烧伤血清作用下，PI3K/Akt介导了BMSCs的迁移。
LY294002是目前应用较广泛的PI3K特异性抑制剂，通过特异性抑制PI3Kpl10亚单位的催化活性，阻碍下游底物PIP3的产生，使该通路处于失活状态。胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor1，IGF-1)是胰岛素样生长因子家族的一种，是通过内分泌、自分泌和旁分泌途径产生的低分子多肽。有研究表明，IGF-1可通过趋化因子受体4信号增加MSCs的迁移，而PI3K/Akt信号通路可能是IGF-1诱导MSCs迁移的重要信号途径[19]。此外，IGF-1在肿瘤侵袭中具有重要作用，可通过PI3K和MAPK信号通路调节人类乳腺癌细胞株MCF-7的金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活动，且IGF-1信号通路还与TGF-β信号通路交互作用，促使人类乳腺癌细胞株MCF-7侵袭及上皮化(epithelial to mesenchymal transitions ,EMT)。烧伤后患者血清是一种具有多种活性成分的复合物，存在集落刺激因子、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、IGF-1、表皮生长因子(EGF)等改变。本实验应用IGF-1后，BMSCs细胞迁移能力增强，可能提高了烧伤血清中IGF-1细胞因子表达，进而激活了BMSCs细胞PI3K/Akt信号通路，调控其表面趋化因子受体表达，促进其迁移，提高BMSCs细胞移植率。提高BMSCs的IGF-1表达，能否通过PI3K/Akt信号通路，促进严重烧伤早期心肌损害的修复有待进一步研究。
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