宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，是导致女性死亡的重要原因^[1]。由于宫颈癌的发病机制不清楚，因此治疗效果较差。研究已证实宫颈癌的发生、发展与高危型人乳头瘤病毒(high risk human papilloma virus,HR-HPV)感染有密切关系^[2]。HPV可能通过一些机制启动癌基因的激活进而使正常细胞发生转化，其中E6原癌蛋白在宫颈癌的发生和维持恶性表达中的作用极其重要，被认为是宫颈癌发生、发展的重要危险因素^[3]。

研究发现，端粒酶活性的异常升高与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生、发展密切相关^[4]，在宫颈癌中HPV主要通过原癌蛋白E6(HPV E6)来促进端粒酶活性。端粒酶的强效抑制因子PinX1是高度保守的核蛋白^[5]，是维持细胞处于最佳生存状态的平衡器。在正常的组织几乎都表达，并且在大部分的肿瘤中都可以发现PinX1的缺失^[6]，因此被公认为是一种重要的抑癌基因。

宫颈癌细胞系中PinX1作为野生型p53的一个新靶基因，可以被HPV E6沉默^[7]，参与宫颈癌的发生、发展，但是在宫颈癌组织中是否存在上述信号通路机制尚不清楚。流行病学研究证实，鳞癌的发病率更高^[8]。因此，本研究选择宫颈鳞癌患者的组织标本，从基因及蛋白水平分别检测HPV E6、野生型p53、PinX1的表达，并分析探讨上述几个分子在宫颈鳞癌发生、发展中的相关性，以期为宫颈鳞癌的临床诊治提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 临床标本和试剂

选择2013年3月至2014年2月第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科17例临床分期为ⅠB1~ⅡA2期的宫颈鳞癌患者宫颈鳞癌及距病灶2 cm 的癌旁组织，标本均经病理证实，宫颈鳞癌纳入标准依据国际妇产科联盟(FIGO，2009年)临床分期标准，患者术前未行放、化疗，年龄30~58(45.1±6.7)岁。选取正常宫颈组织10例作为对照，纳入标准：无HPV感染、无恶性肿瘤、子宫颈疾病的子宫肌瘤患者，年龄44~58(49.3±5.6)岁。本研究经第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

TRIzol总RNA提取试剂盒购自康为世纪公司，M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，Oligo DT和dNTP混合液购自天根公司，HPV E6、p53、PinX1和β-actin的特异性引物由上海生工合成，2×SYBR Green Supermix 购自TaKaRa 公司；一抗：鼠抗人HPV16+HPV18 E6抗体(ab70)、鼠抗人p53抗体(ab28)、兔抗人PinX1抗体(ab118255)均购自Abcam公司，GADPH抗体购自碧云天公司；二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自碧云天公司，二抗：二步法免疫组化试剂PV-9000购自北京中杉金桥公司。 1.2 Real-time PCR检测HPV E6、p53、PinX1 mRNA表达

根据总RNA试剂盒TRIzol使用说明书，提取宫颈组织中的总RNA并逆转录cDNA。各引物序列见表 1。Real-time PCR总反应体系20 μL：上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR Green Supermix 10 μL，灭菌超纯水8 μL；Real-time PCR反应条件：95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；为计算基因的变化量，用β-actin作为内参，每个样品3个复孔，每个复孔之间循环数相差<0.5 作为有效数据取平均值(CT)。根据所得各组CT值计算宫颈鳞癌、癌旁及正常组织中HPV E6、p53、PinX1的mRNA相对表达量，用2^-△△Ct值表示。

加入含有蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA裂解液(1 ∶10)1 mL，玻璃匀浆器充分研磨，裂解，震荡，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清并用BCA法测量蛋白浓度，经浓度标化后进行Western blot 检测。取60 μg蛋白样品上样进行10% SDS-PAGE(12% SDS-PAGE用于HPV E6)；一抗工作浓度：鼠抗人HPV16+HPV18 E6(1 ∶250)，鼠抗人p53(1 ∶1 000)，兔抗人PinX1(1 ∶1 000)，内参GADPH(1 ∶5 000)，一抗4 ℃摇床过夜；用含0.1% Tween20的PBST洗膜3次，每次10 min，二抗：使用HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，37 ℃摇床2 h；按ECL试剂盒说明书进行电化学发光检测。 1.4 免疫组化检测HPV E6、p53、PinX1的表达、分布

标本组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，切片，厚度5 μm，60 ℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，柠檬酸高温高压抗原修复；一抗4 ℃过夜，一抗工作浓度：鼠抗人HPV16+HPV18 E6(1 ∶100)，鼠抗人p53(1 ∶100)，兔抗人PinX1(1 ∶100)；二抗pv-9000孵育；DAB染色，复染，梯度酒精脱水，中性树脂封片，40倍物镜拍片。 1.5 统计学分析

数据以x±s形式表示，采用SPSS 17.0统计软件对计量数据行单因素方差分析及t检验，采用Spearman相关分析分析HPV E6、野生型p53和PinX1表达水平的关系。 2 结果 2.1 正常组织、癌旁组织和宫颈鳞癌组织中HPV E6、p53、PinX1 mRNA 表达

在宫颈鳞癌中HPV E6的表达明显高于癌旁(P<0.01)，p53及PinX1在宫颈鳞癌组织中表达下降(P<0.05)，低于癌旁组织及正常组织(表 2)。

免疫组化结果(图 1)显示：HPV E6阳性细胞呈棕黄色，主要定位于肿瘤细胞的细胞核和细胞质，以细胞质表达为主；而p53及PinX1阳性表达主要定位于细胞核。Western blot结果(图 2)显示：10例正常组织中，8例HPV E6几乎无表达，2例HPV E6微量表达；宫颈鳞癌组织中HPV E6的表达水平明显高于癌旁组织，而p53和PinX1的表达水平在宫颈鳞癌组织中有降低。

图 1 免疫组织化学检测HPV E6、p53和PinX1在3种组织中的表达和分布 (S-P ×400)

图选项

A: Western blot结果 1：正常组织；2：宫颈癌组织；3：癌旁组织；B：半定量分析 a: P<0.01，与宫颈鳞癌组织比较 图 2 Western blot检测宫颈鳞癌组织、癌旁组织和正常组织中E6、p53和PinX1的蛋白表达

图选项

Spearman相关分析结果显示：宫颈鳞癌组织中 p53与E6的表达水平呈负相关(R=-0.605，P<0.01)，PinX1与E6的表达水平呈负相关(R=-0.496，P<0.05)，p53与PinX1的表达水平呈正相关(R=0.824，P<0.01)。 3 讨论

99%宫颈癌患者合并HPV感染，大多数女性在感染高致病HPV后机体能自动清除感染，少数(1%~3%)的患者存在持续的HPV感染^[9]。研究已证实高致病的HPV E6蛋白是宫颈癌发生和维持恶性肿瘤表达必不可少的肿瘤蛋白^[3]。本研究亦发现高危型HPV E6在宫颈鳞癌组织中表达上调，而HPV E6在正常宫颈组织中几乎不表达，或因炎症刺激所致微量表达，进一步证实高危型HPV E6可能在宫颈鳞癌发病机制中发挥着重要作用。

P53是肿瘤相关重要因子，分为野生型和突变型，野生型p53是重要的信号调节因子，称为基因组守护者^[10]。研究发现，大约有一半的人类肿瘤中p53基因发生了突变，突变型p53使损伤的DNA以及发生突变的细胞进行复制，p53从抑癌基因转变成了癌基因。但在宫颈癌的相关研究中，p53很少发生突变，研究发现野生型p53的失活对宫颈癌发生起着重要作用^[11]。近期研究表明，在HPV感染的宫颈癌细胞中，E6蛋白可下调野生型p53，其主要机制有：① 通过与野生型p53蛋白相互作用，并招募E6相关蛋白(E6 associated protein，E6AP)，从而形成“E6-p53-E6AP”三聚体，进而通过E6AP的泛素连接酶作用，启动对野生型p53的泛素化蛋白酶体降解过程^[12]，致使野生型p53水平下降；② 通过抑制野生型p53的表达而下调野生型p53水平。此外，近年研究还证实，野生型p53蛋白是一种重要的转录因子，调节多个基因的表达调控^[13]。高致病HPV E6通过与野生型p53的核心区域绑定从而对野生型p53表达水平进行下调^[14]，通过抑制野生型p53的活性进而导致促进细胞凋亡的能力明显降低，在其他因素的诱导下，进展为宫颈癌。本研究中，我们从基因及蛋白水平均发现宫颈鳞癌组织中HPV E6表达水平上调，而野生型p53表达水平下降，结合文献报道，我们推测野生型p53表达水平下降可能与HPV E6表达水平上调有关。

人体正常细胞中，端粒酶抑制因子PinX1的过度表达会抑制端粒酶的活性，诱导细胞凋亡。PinX1的主要功能包括：① 通过抑制hTERT的活性而使细胞增殖处于可控的正常过程^[15]；② 维持细胞在有丝分裂过程中端粒的完整性^[16]，并增强染色体的稳定性。体外实验和体内裸鼠成瘤实验发现，PinX1的过表达有显著的抑瘤效果，而PinX1的缺失则有显著促瘤作用^[17]。在前列腺癌、胃癌、成神经管细胞瘤、卵巢癌中证实了PinX1在保持染色体的稳定性起着重要作用^[6]，PinX1表达下调的机制对相关肿瘤的治疗有很重要的意义，但在宫颈癌组织中其表达情况目前尚不清楚。本研究从基因及蛋白水平检测了宫颈鳞癌组织中PinX1的表达情况，结果显示宫颈鳞癌组织中PinX1表达显著低于正常对照组，提示其表达水平降低可能导致端粒酶活性增强是诱发宫颈癌发生、发展的重要机制之一。文献^[6]报道PinX1与野生型p53有特异结合位点，当野生型p53受到HPV E6调节而表达降低时，野生型p53特异结合位点作用减弱，PinX1的转录因此减弱。本研究亦发现宫颈鳞癌组织中野生型p53表达水平显著下降，我们认为野生型p53的表达水平与PinX1存在正相关性，宫颈鳞癌中野生型p53表达的降低极可能是导致PinX1的表达水平下降的重要因素之一，但Pinx1是否受野生型p53以外其他基因的调控，在宫颈鳞癌中端粒酶的活性和长度的变化是否与HPV E6、野生型p53、Pinx1表达存在相关性，还需更多深入的研究。

本研究从基因及蛋白水平证实：宫颈鳞癌组织中HPV E6表达水平明显高于癌旁组织，与野生型p53以及Pinx1表达量呈负相关。PinX1在癌组织中表达水平明显低于癌旁以及正常组织，并且与野生型p53的表达量呈正相关的关系。该结果为文献^[7]中宫颈癌细胞系的研究结果提供了佐证。本研究进一步证实了宫颈鳞癌的发生可能与HPV E6表达显著上调相关，表达上调的HPV E6可能通过抑制组织中野生型p53、 PinX1表达，使得端粒酶的活性增强，该途径可能是导致宫颈鳞癌的发生、发展的重要发病机制之一。本研究结果为深入研究宫颈鳞癌的发生、发展提供理论基础，有望为将来宫颈鳞癌临床诊治提供新的新靶点。