压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)的发病机制主要与尿道内平滑肌和横纹肌的减少有关。临床上治疗SUI的最佳治疗手段是运用组织替代物进行盆底修复^[1]，目前用于盆底修复的组织工程支架包括合成聚合物、天然细胞外基质、脱细胞基质衍生物三大类。脱细胞基质衍生物因其组织完整性好，免疫原性低等优点被广泛运用于膀胱壁的修补和皮肤、气管的重建^{[2, 3, 4]}。猪膀胱细胞外基质(urinary bladder matrix,UBM)属脱细胞基质衍生物的一种，近年来逐渐被运用于盆底修复^[5]。但是目前无法有效控制UBM的降解周期，单纯的靠增加植入的UBM材料来缓解降解周期的方法只会导致严重的免疫排斥反应，造成手术失败。临床上一直对种子细胞——骨髓间充 质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 寄予厚望，然而BMSCs向平滑肌分化的机制研究不足，以至于临床运用欠佳。众多研究发现UBM的基底层中含有Laminin蛋白^[6]，而Laminin蛋白具有促进多种成体干细胞等细胞增殖并向其他细胞分化的能力^{[7, 8, 9]}。但在UBM材料Laminin蛋白是否具有诱导BMSCs向平滑肌细胞分化增殖的能力尚不清楚。本研究旨在对现有的UBM材料进行完善，使其具有诱导BMSCs向植入部位分化的能力，从而达到组织修复的目的。

3~4周龄雌性清洁级SD大白鼠10只，体质量约120 g。封闭饲养猪(体质量约200 kg)，取处死30 min以内猪的新鲜膀胱,保存于4 ℃磷酸盐缓冲液内，实验动物由第三军医大学实验动物中心提供。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，十二烷基硫酸钠(SDS),DNA 酶及RNA 酶(北京鼎国生物技术有限公司)，DMEM-F12、双抗、胰酶购于HyClone 公司，DAPI、CCK-8试剂盒购于碧云天公司，胎牛血清( FBS ) 购于Gbico公司，FITC标记的小鼠抗大鼠CD29、CD31和CD34抗体购于Santa Cruze公司，兔抗猪Laminin抗体、兔抗鼠α-SMA抗体购于Abcam公司，Laminin蛋白购于Sigma公司，PBS 缓冲液(中杉金桥公司)；冻干机，⁶⁰COγ辐照仪，流式细胞仪，CO₂培养箱，CK2 型倒置相差显微镜，Bio-Rad 680 XR 型酶标仪等。

①机械分离：参照Freytes法^[10]，用PBS清净膀胱中残留尿，将膀胱内装满1.0 mmol/L的氯化钠，用机械分离法去除脂肪组织：浆膜层以及肌肉层，其余残留的黏膜层及固有鞘膜即UBM。②脱细胞，去污迹法，将分离下来的组织浸泡于含 0.035 mmol/L PMSF 的50 mmol/L Tris(pH=8.0)缓冲液中，室温下反复浸泡8次，每次12 h。酶消化，将上述处理后组织经PBS洗涤后置入含DNA酶及RNA酶的双酶消化液中，浸泡处理2次，每次12 h；使用PBS漂洗后，置入含1%SDS的TRIS缓冲液，室温反复浸泡处理4次，每次12 h。取出后用大量PBS缓冲液 充分漂洗4次，每12小时更换1次。③冻干及消毒处理：上述处理后的膀胱已经成为脱细胞基质，取出后程序性降温至-80 ℃，16 h，再置于冷冻机干燥(第三军医大学药学院)，⁶⁰COγ射线照射灭菌(第三军医大学辐照中心)，4 ℃无菌保存备用。

取成品脱细胞材料用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(4 μm)，分别用HE及 Masson染色后光学显微镜下观察。另一组材料用体积分数为2.5%戊二醛和1%锇酸固定，梯度酒精逐级脱水，置换，临界干燥后喷金，扫描电镜学观察其脱细胞情况和纤维排列情况。

大鼠BMSCs分离、培养采用全骨髓贴壁法，具体如下：颈椎脱臼法处死大鼠，无菌操作下取双侧胫骨、股骨，用DMEM-F12培养液反复冲洗骨髓腔，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，用密度梯度离心法收集白色雾状细胞层，用含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素和青霉素的DMEM-F12培养液重悬，并接种于培养瓶，置37 ℃的5% CO₂培养箱中培养。24 h后首次换液，隔天换液，细胞接近80%～ 90%融合时按1 ∶2~1 ∶3 传代。应用流式细胞仪对BMSCs的表面分子CD29、CD31、CD34进行鉴定。本实验主要使用第3代细胞。

根据Lindner等方法^{[9, 11]}将UBM材料剪成直径约1.6 cm大小，置入24孔板内，加入75%的乙醇1 mL，置于超净工作台上待乙醇自然彻底挥发。加灭菌PBS 2 mL浸泡洗涤2次，每次2 h。将Laminin蛋白及Anti-Laminin抗体分别用PBS溶液配制成终浓度30 μg/mL 的溶液，每孔加入2 mL Laminin蛋白溶液或Anti-Laminin溶液，无菌密封后，置于4 ℃冰箱，孵育12 h。

取成品脱细胞材料(UBM、UBM+Laminin及UBM+ Anti-Laminin)用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片(8 μm)。常规脱蜡水化，PBS漂洗后3%过氧化氢溶液室温孵育20 min，PBS漂洗后柠檬酸组织抗原修复液高压修复，待自然冷却后加兔非免疫血清(S-P试剂盒)孵育10 min，除去血清，每张玻片加50 μL兔抗猪Laminin抗体(1 ∶25稀释)，置湿盒4 ℃过夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加二抗孵育10 min，链霉素抗过氧化物酶溶液孵育10 min，DAB溶液显微镜下显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片后光学显微镜观察。

将预处理的3组材料置于24孔板中，取第3代BMSCs按1×10⁵/cm²接种于不同支架上，对照组为单纯UBM材料。每组加1 mL细胞培养液，置于37 ℃、5%CO₂及饱和湿度下培养，隔日换液，并观察培养液有无浑浊。分别取培养3、5、7、14 d的组织行HE染色，观察细胞迁移情况。并取14 d的组织行免疫组化染色，观察干细胞向平滑肌细胞分化情况。

将预处理的3组材料平铺于96孔板，取第3代BMSCs，按3×10³/孔接种于96孔板，空白对照组为单纯UBM材料，每孔加120 μL的细胞培养液，每组5孔，置于37 ℃、5%CO₂及饱和湿度下培养，隔日换液，并观察培养液有无浑浊。分别取培养1、3、5、7、9、12、14 d的组织行CCK-8检测(在450 nm波长测光密度值)。

应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。

HE染色观察 UBM由质地均匀的基质和细丝状的胶原纤维构成(图 1A)，Masson染色可见UBM胶原结构完整(图 1B)。扫描电镜显示UBM的胶原构成多个三维立体的孔隙，有利于细胞的黏附(图 2)。均未发现蓝色核染样结构，表明脱细胞处理彻底。

图 1 HE(A)和Masson(B)染色观察UBM组织结构 (×200)

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A:×500；B×1 000；C：×4 000 图 2 扫描电镜观察UBM组织超微结构

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倒置显微镜下观察可见原代分离的大鼠BMSCs呈针尖样贴壁生长，培养7~8 d细胞达90%融合，细胞呈多克隆、旋涡状生长(图 3A)。传代BMSCs呈较均一的长梭型，分布均匀，增殖旺盛( 图 3B)。流式细胞仪检测显示，BMSCs稳定表达中胚层来源细胞的CD29 分子，阳性率为98%，内皮细胞的特征性表型分子CD31及造血干细胞系的特征性分子CD34表达阴性，阳性率分别为4.56%和3.30%( 图 3C)，符合间充质干细胞的特征。

A: 倒置显微镜下观察BMSCs P0代 (×100); B: 倒置显微镜下观察BMSCs P3代(×100)；C~E：分别为流式细胞仪检测BMSCs CD29、CD31、CD24表达 图 3 BMSCs的鉴定

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3组材料上Laminin蛋白均表达阳性，单纯UBM组基底层的黏膜面可见不连续的线状染色(图 4A)，UBM+Laminin组相比其他2组基底层黏膜面线条增粗，且染色加深(图 4B)UBM+Anti-Laminin组黏膜面线条染色减弱，仍可见部分染色阳性的血管腔样结构 (图 4C)。Laminin蛋白可以复合到UBM材料上，UBM材料表面的部分Laminin可以被抗体封闭。

A:脱细胞UBM; B：UBM+Laminin; C: LBM+Anti-Laminin 图 4 免疫组化观察3组材料上Laminin蛋白表达 (S-P ×100)

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CCK-8法检测表明3组材料上BMSCs细胞生长曲线变化趋势类似(图 5)，在培养7 d内，细胞增殖不明显，处于潜伏适应期，培养7~9 d，BMSCs细胞进入对数生长期，9 d以后达到平台期。培养7 d以后，3组的增殖速度出现差异，与UBM组比较，UBM+Laminin组对BMSCs细胞增殖有显著促进作用(P<0.01)，而UBM+Anti-Laminin组与UBM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

a: P<0.01,与UBM组比较 图 5 CCK-8法检测3组材料上BMSCs细胞增殖

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BMSCs负载支架上培养第3天，所有支架表面均有细胞生长，而UBM+Laminin组有多层细胞附着，并且随着接种时间的延长，明显见细胞向深层迁移，于第14天可到达基底层顶端，细胞与基底膜融合，细胞核拉伸延长；UBM组绝大部分BMSCs依旧聚集在UBM内部，尚未达基底层顶端。但在UBM+Anti-Laminin组绝大部分BMSCs依旧附着在材料表面，仅有少数细胞迁移至材料内部(图 6)。

图 6 HE染色观察3组材料上负载BMSCs迁移 (×200)

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接种14 d的组织行α-SMA免疫组化检测发现，UBM+Laminin组平滑肌标志性蛋白α-SMA表达呈明显阳性，单纯UBM组α-SMA表达呈弱阳性，UBM+Anti-Laminin组α-SMA表达阴性(图 7)。

A:UBM+Laminin组α-SMA染色阳性的BMSCs; B:UBM组α-SMA染色弱阳性的BMSCs；C:UBM+Anti-Laminin组α-SMA染色阴性的BMSCs 图 7 免疫组化染色检测BMSCs接种第14天3组材料上α-SMA的表达 (S-P ×200)

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SUI是一个普遍的社会和卫生问题,其发病率较高，严重影响患者家庭和生活质量^[12]。研究表明其病因与尿道内平滑肌和横纹肌的减少有关^[13]，目前针对该类疾病的治疗中，生物类材料具有诱人的前景。猪膀胱脱细胞基质易于获得和处理，保留了较多生物活性因子，如：黏附分子、层粘连蛋白(Laminin)等^[6]，并具有一定的力学性能和较好的组织相容性^[5]，是目前研究的热点。BMSCs具有增殖和多项分化潜能^[14]，被寄予希望在盆底功能修复和尿失禁治疗中担负重要角色，然而其向平滑肌方向分化的机制研究尚不足，以至于临床运用效果欠佳。

Laminin蛋白是构成细胞外基质的主要成分之一，近年来多项在器官发育领域的研究报道了Laminin蛋白能诱导胚胎干细胞及神经干细胞等多种成体干细胞定向分化^{[7, 8]}。同时体外研究发现Laminin蛋白具有促进骨髓间充质干细胞增殖^[11]，并且诱导其向成骨细胞等方向分化的能力^[15]。但它对参与盆底修复的BMSCs的作用却尚不清楚。

本研究通过机械分离、酶消化、冻干及消毒获得成品UBM材料，脱细胞处理干净，胶原纤维保留完整，符合实验要求，且免疫组化发现在UBM的基底层有Laminin蛋白的表达，验证了Brown等^[6]的报道。随后使用共孵育法将Laminin蛋白与UBM制成Laminin复合支架，同时用抗Laminin单克隆抗体成功封闭UBM材料浅层Laminin蛋白做对照实验组。用CCK-8检测并绘制出细胞生长曲线图，发现细胞在接种第9天后UBM+Laminin支架组增殖率明显高于其余2组，并且差异有统计学意义(P<0.01)。再者我们发现UBM+Anti-Laminin组细胞绝大多数仅在表面生长，未见明
显细胞向深层迁移，并且总体细胞密度低于UBM+Laminin组及UBM组。类似的实验结果在Badylak及Soiderer等^[16]的报道中也能看到。有报道UBM的基底层面中含有层粘连蛋白(Laminin)、胶原蛋白、串珠素等结构蛋白，这些蛋白与相应受体结合，来调节细胞生长、迁移和分化，在组织工程运用中起重要作用^[17]。 Laminin蛋白通过其LG功能域^[18]与干细胞的受体-integrin a6β1^[19]结合，从而诱导干细胞定向分化。而本实验结果进一步明确了Laminin蛋白可以促进BMSCs的生长、增殖以及向材料深部迁移的作用。

新型生物材料在解决排斥反应的基础上，若能诱导潜能干细胞定向分化为修复部位细胞，则是解决问题的关键。因此，我们更进一步检测了共培养第14天材料上平滑肌标志性蛋白α-SMA的表达，结果显示在UBM+Laminin组细胞胞核染色呈明显阳性，UBM组个别细胞检测阳性，而抗体封闭组检测阴性。这表明UBM+Laminin上BMSCs已有部分细胞向平滑肌细胞分化，表达平滑肌细胞标志物，所以我们认为Laminin也具有诱导BMSCs向平滑肌方向分化的能力。

综上，本研究结果表明UBM材料上的Laminin蛋白具有促进负载BMSCs增殖、迁移并向平滑肌分化的能力。为尝试运用Laminin复合UBM支架作为新型盆底修复材料提供了理论依据，为治疗压力性尿失禁提供了诱人前景。本研究存在的不足之处在于仅体外研究了UBM上Laminin蛋白对骨髓间充质干细胞生长的影响，下一步可将支架植入体内，观察骨髓间充质干细胞在植入部位迁移及分化情况，在体内进一步验证UBM上Laminin蛋白对骨髓间充质干细胞生长的影响，如结果与本实验结果一致，可考虑将此法进一步应用到临床试验。