400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院,血液科实验室2;
400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院,实验研究中心3
2Laboratory of Hematology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China;
3Central Laboratory, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是浆细胞的恶性克隆性肿瘤,以溶骨性骨损害、高钙血症、肾功能损害、继发性贫血、感染等病理变化为主要临床表现,其发病率居血液肿瘤的第2位[1, 2]。目前尽管新药(如硼替佐米、雷利度胺)的应用、化疗方案及干细胞移植技术的改善使其治疗缓解率提高,由于其复发、耐药等原因,MM仍为不能完全治愈的恶性肿瘤[3, 4]。因此,仍迫切需要MM的分子发病机制及相关治疗药物的研究。
原钙粘蛋白-10(procadherin-10,PCDH10)基因为近年新发现的抑癌基因,属δ2原钙粘蛋白家族,主要参与钙依赖性的细胞之间特异性的黏附、调节特异性细胞之间的相互识别及多种信号通路的传导[5]。研究发现PCDH10 基因在胃癌、乳腺癌、膀胱癌、淋巴瘤及子宫内膜癌等肿瘤中均因启动子高度甲基化导致其表观遗传沉默[6, 7, 8]。已有研究发现PCDH10还可作为评估患者复发及预后的生化标志[9, 10, 11]。本课题组前期研究发现,PCDH10在MM中亦因其启动子甲基化而沉默,从而促进MM的增殖、侵袭及血管形成,去甲基化后能抑制细胞的增殖、迁移、血管新生[12, 13, 14]。此外,PCDHGC3、PCDHs 及PCDH-P均为原钙粘蛋白家族成员,其生物学机制与Wnt/β-catenin信号通路有关[15, 16, 17],Wnt/β-catenin信号通路的异常激活广泛参与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药等生物学行为,并在MM 疾病的发生、发展过程中发挥了重要作用[2, 3]。 然而,PCDH10是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制MM细胞增殖尚不清楚。因此,本实验采用脂质体转染法过表达PCDH10基因,进一步探讨PCDH10基因在MM细胞中的作用及机制,为PCDH10基因在MM的临床治疗及预后判断的应用中提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞由上海第二军
医大学长征医院血液科侯健教授惠赠。pcDNA3.1(+)TP53质粒和pcDNA3.1-PCDH10质粒由香港中文大学陶谦教授惠赠。pTOPflash、pFOPflash、pRL-SV40质粒(Millipore 公司),RPMI1640、胎牛血清(Gibco公司);DNA Marker500、Go-Taq DNA 聚合酶(武汉博士德公司);Lipofectamine2000(Invitrogen 公司);CCK-8试剂盒(Sigma公司);TRIzol、PCR试剂盒及PCR引物(TaKaRa公司);BCA试剂盒、蛋白裂解液、SDS-PAG凝胶试剂盒(碧云天公司);质粒提取试剂盒(Omega 公司)β-actin、β-catenin 、Cyclind1 单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司);c-Myc、TBP单克隆抗体(Abcam公司);山羊抗兔荧光二抗 (Proteintech公司)。质粒双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega 公司),倒置荧光显微镜(卡尔蔡司公司);流式细胞仪、37℃恒温培养箱。
KM3细胞株于RPMI1640 培养(含 10%FBS),5% CO2、37℃、饱和湿度下培养。取对数期细胞进行实验。实验分为对照组、空载体组和转染组。提取质粒后,按照Lipofectamine2000说明书将空质粒pcDNA3.1(+)TP53和质粒pcDNA3.1-PCDH10分别转入KM3细胞中。转染72 h后,用G418筛选稳定株。
1.3 LiCl最佳浓度的筛选将KM3细胞用无血清的RPMI1640同步化培养 12 h后,加不同浓度的LiCl(0、5、10、15及20μmol/mL)刺激KM3细胞,48 h后RT-PCR测定β-catenin的表达,并选取LiCl 最佳作用浓度。后续实验中均采用此浓度分别处理对照组、空载体组及转染组的KM3细胞。
1.4 PT-PCR、qRT-PCR 检测β-catenin、c-Myc及Cyclind1基因 mRNA的表达按照TRIzol试剂盒说明书提取RNA,并参照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。用RT-PCR鉴定PCDH10及β-catenin的表达。qRT-PCR测定β-catenin、Cyclind1及c-Myc的mRNA表达。qRT-PCR扩增总反应体系为10μL,反应条件为: 95℃ 预变性2 min,1个循环;95℃变性 30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s;为35个循环;最后72℃ 延伸3 min。RT-PCR扩增体系为12.5μL,反应条件同上,之后用产物进行琼脂糖凝胶电泳(2%)。 RT-PCR结果用Quantity One 软件计算灰度值后再进行统计学分析,qRT-PCR 结果采用Bio-Rad CFX Manager 3.0软件计算出基因表达量后进行统计学分析。相关基因的引物序列见表 1。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) |
PCDH10 | 上游:ACTGCTATCAGGTTGCCTG | 219 |
下游:GTCTGTCAACTAGATAGCTG | ||
β-catenin | 上游:TGGTGACAGGGAAGACATCA | 108 |
下游:CCATAGTGAAGGCGAACTGC | ||
c-Myc | 上游:GAGACAGATCAGCAACAACCGA | 227 |
下游:CTGCTTGGACGGACAGGATG | ||
Cyclind1 | 上游:TTCGTTGCCCTCTGTGCCA | 196 |
下游:GAAGCGTGTGAGGCGGTAGTAG | ||
β-actin | 上游:CCACGAACTACCTTCAACTCC | 132 |
下游:GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT |
取不同处理组对数生长期细胞,按照总蛋白试剂盒及核蛋白提取试剂盒说明提取细胞蛋白及BCA法蛋白定量试剂盒说明分别提取总蛋白及细胞核蛋白并进行定量。SDS-PAGE电泳分离蛋白,250 mA 恒流转膜,根据蛋白的分子量设定转膜时间。将膜于5% BSA溶液中封闭2 h,加入一抗(PCDH10 1∶1 200、 β-catenin 1∶800、c-Myc 1∶5 000、Cyclind1 1∶800、β-actin 1∶2 000、TBP 1∶5 000),4℃孵育过夜。 加入二抗(1∶2 000),37℃孵育90 min,将ECL显影液均匀滴加在膜上,暗示曝光显影。结果采用Fusion软件分析。
1.6 双荧光素酶报告基因系统检测PCDH10基因与LEF/TCF基因的关系将3组细胞用无血清1640培养基培养3 h后,每孔细胞用Lipofectamine 2000共转染pTOPFlash或pFOPFlash和pRL-SV40,每个剂量组各设3个复孔。以pRL-SV40作控制转染效率的内对照。48 h后按双荧光素酶报告基因系统试剂盒说明书操作,立即用荧光检测仪作荧光定量测定。
1.7 流式细胞仪和CCK-8分别检测细胞周期、细胞增殖能力收集3组细胞,细胞数达1×106个,PBS清洗3遍,用70%的冰乙醇固定5 h后,用流式细胞仪检测细胞周期,Cell Quest软件进行分析。将细胞接种到96孔板,同一培养条件分别培养0、24、48、72 h及96 h,每孔加10μL CCK-8溶液继续孵育3 h,终止培养,选择450 nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光密度值[D(450)]。以时间为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制生长曲线。实验重复3次。
1.8 免疫荧光检测β-catenin 核转位收集3组细胞,取细胞悬液10μL滴于玻片上。4%多聚甲醛固定15 min,0.5%Triton X-100透化15 min,山羊血清封闭30 min,孵育一抗β-catenin(1∶100),4℃孵育过夜。次日复温1 h,孵育荧光二抗(1∶200),孵育约90 min后,PI染核5 min,PBS 清洗,风干后甘油封片。用荧光卡尔蔡司荧光显微镜(×400)观察β-catenin的表达。
1.9 统计学分析计量资料以x±s表示,采用SPSS 18.0统计软件进行独立样本t检验。
2 结果 2.1 转染后KM3细胞中PCDH10的表达RT-PCR、Western blot检测结果显示,PCDH10转染后的KM3细胞在mRNA及蛋白水平均有PCDH10的稳定表达,对照组、空载体组细胞难以检测到PCDH10的表达(图 1)。
2.2 不同浓度LiCl处理KM3细胞后β-catenin的表达RT-PCR 检测结果发现:用不同浓度LiCl处理KM3细胞48 h后,β-catenin的表达随LiCl浓度增高逐渐增加,浓度达20μmo/mL时,β-catenin的表达量增加最明显,与0μmol/mL组比较,差异有统计学意义(P<0.05);浓度为5、10、15μmol/mL时,与0μmol/mL 组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。故选取20μmol/mL作为LiCl对KM3细胞的作用浓度(图 2)。
2.3 PCDH10对各组细胞增殖能力的影响CCK-8检测结果显示:未经LiCl处理的转染组细胞48 h开始 增殖速度明显落后于对照组、空载体组,差异有统计学意义(P<0.05); LiCl处理后则于24 h时开始差异有统计学意义(P<0.05,图 3)。
2.4 PCDH10对各组细胞周期的影响流式细胞仪检测发现:转染组与对照组、空载体组比较,G1期的细胞分布增加,增殖指数降低(P<0.05)。经LiCl处理后,转染组与对照组、空载体组相比,G1期的细胞分布明显增加,增殖指数明显降低(P<0.05,图 4,表 2)。
(x±s) | ||||
组别 | G1期(%) | S期(%) | G2期(%) | 增殖指数 |
对照组 | 38.60±2.61 | 43.07±2.96 | 18.33±3.21 | 0.614±0.026 |
空载体组 | 41.28±3.25 | 42.80±3.23 | 15.92±2.13 | 0.587±0.032 |
转染组 | 51.09±2.14 | 40.11±2.48 | 8.80±2.19 | 0.489±0.021a |
对照组+LiCl | 12.91±4.43 | 50.52±2.47 | 36.56±3.88 | 0.854±0.043 |
空载体组+LiCl | 15.11±1.67 | 51.80±2.82 | 33.08±2.64 | 0.826±0.017 |
转染组+LiCl | 47.78±2.24 | 47.27±1.63 | 4.95±1.39 | 0.529±0.024b |
a:P<0.05,与对照组、空载体组比较;b: P<0.05,与对照组+LiCl、空载体组+LiCl比较 |
双荧光素酶法检测结果发现:与对照组、空载体组比较,转染组细胞中pTOPFlash活性(LEF/TCF基因 活性)显著下调(P<0.05);LiCl处理后,对照组、空载体组细胞pTOPFlash活性明显升高,而转染组细胞中pTOPFlash活性仍显著低于对照组、空载体组(P<0.05)。而阴性对照pFOPFlash 的表达在对照组、空载体组与转染组之间无明显差异(P>0.05,图 5)。以上结果表明,PCDH10 基因可明显下调LEF/TCF基因的活性。
2.6 各组细胞β-catenin、c-Myc和Cyclind1的表达qRT-PCR检测结果显示:与对照组、空载体组比较,转染组细胞中c-Myc和Cyclind1的mRNA表达水平明显降低(P<0.05),β-catenin mRNA表达水平无明显降低(P>0.05,图 6A)。Western blot结果显示:与对照组、空载体组比较,LiCl刺激前,转染组的细胞中β-catenin、c-Myc和Cyclind1蛋白表达均明显减弱;LiCl刺激后,c-Myc的表达亦明显降低(P<0.05),β-catenin、Cyclind1的蛋白表达稍有增高,但仍低于对照组、空载体组(P<0.05,图 6B、C)。
2.7 各组细胞核内β-catenin的表达Western blot检测结果发现:LiCl处理前后,与对照组、空载体组比较,转染组细胞核内β-catenin的表达明显下调(P<0.05,图 7)。
2.8 PCDH10基因对β-catenin细胞内核转位的影响免疫荧光显微镜下观察,与对照组、空载体组相比,转染组的β-catenin荧光强度降低,主要分布于胞浆内,核内表达明显减少,而对照组、空载体组β-catenin主要分布于细胞核内。LiCl处理后转染组β-catenin在细胞核内的表达仍明显低于对照组、空载体组,而对照组、空载体组β-catenin主要分布于细胞核内,荧光强度增高(图 8、9)。
3 讨论近年来,MM发病率仍逐年增加,并有年轻化的势,虽然新的靶向治疗药物及移植技术的改善提高了MM的治疗效果,但由于复发、耐药及多种不良预后因素等原因导致MM仍为不可治愈的疾病。因此,有关MM的发病机制及分子靶向药物的研究具有重要意义。本课题组研究发现,PCDH10的甲基化促进了KM3细胞的增殖、侵袭及血管形成等生物学行为,但PCDH10抑制KM3细胞增殖的机制尚未清楚。
Wnt/β-catenin信号通路的活化关键在于β-catenin在细胞内大量累积,并从胞浆转入细胞核内从而与LEF/TCF基因结合激活下游靶基因c-Myc及Cyclind1的表达,靶基因的异常表达促进肿瘤的增殖[2, 3]。本实验采用双荧光素酶报告基因检测系统分析发现PCDH10可以明显抑制LEF/TCF基因的活性,从而抑制KM3细胞c-Myc及Cyclind1的表达,进一步抑制KM3细胞的增殖能力,细胞周期阻滞于G1期,增殖指数下降;LiCl处理后,转染组细胞周期分布、周期蛋白Cyclind1及c-Myc的表达与未经LiCl处理的转染组细胞结果一致。LiCl是GSK-3β的抑制剂,使胞浆内β-catenin磷酸化减少,游离β-catenin增多,从而导致β-catenin核内表达增加,与LEF/TCF的结合体增多,靶基因如c-Myc及Cyclind1的表达增强。由于PCDH10基因可以明显抑制LEF/TCF基因的活性,导致β-catenin与LEF/TCF的结合体减少,c-Myc及Cyclind1的表达降低,KM3细胞增殖减弱。
本实验发现,PCDH10基因对β-catenin mRNA表达水平没有明显的抑制作用,但Western blot检测结果发现PCDH10基因的高表达可抑制KM3细胞内β-catenin蛋白的表达,其作用机制首先可能为PCDH10蛋白与β-catenin蛋白的结合,使胞浆内游离的β-catenin减少;其次,本课题组前期研究发现PCDH10基因可抑制PI3K/AKT活性[18],由于PI3K/AKT活性下降可减少AKT对GSK-3β的抑制作用,进而导致β-catenin的磷酸化增加,游离β-catenin减少[19, 20]。免疫荧光显微镜下可观察到,对照组细胞中β-catenin主要分布于细胞核内,而转染PCDH10基因后,β-catenin核内表达减少,其机制可能与胞浆中游离的β-catenin减少有关。LiCl处理后,对照组、空载体组细胞核内β-catenin明显增高,而转染组细胞中β-catenin增高不明显,结果表明,PCDH10基因抑制KM3细胞增殖活性的主要机制与抑制核转录因子LEF/TCF基因的活性有关。
综上所述,PCDH10基因可抑制Wnt/β-catenin信号通路中的核转录因子LEF/TCF基因的表达及β-catenin在细胞浆内的累积,从而使得细胞核内β-catenin与LEF/TCF的结合体减少,降低靶基因c-Myc及Cyclind1的表达,抑制KM3细胞增殖。PCDH10基因除了与LEF/TCF基因有关,是否还与其他基因有关,尚有待于进一步的研究。研究发现,在胃癌、结肠癌及前列腺癌中,检测PCDH10的表达可以判断肿瘤的预后[9, 10, 11],并且PCDH10蛋白在血浆中检测的敏感度较肿瘤组织高[21]。此外,c-Myc是参与肿瘤耐药的重要分子,并能降低肿瘤对化疗药物的敏感性[22, 23],本实验发现PCDH10能明显抑制c-Myc的表达,提示PCDH10的高表达具有降低肿瘤耐药及增强肿瘤药物敏感性的潜能。这些研究结果表明,PCDH10基因在肿瘤的临床诊断、治疗及预后中有广泛的应用前景。PCDH10基因能否降低肿瘤耐药及增加化疗药物的敏感性是本课题组下一步的研究内容。
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