皮肤的损伤修复需要表皮细胞不断增殖迁移以维持皮肤表面完整性。而间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有高度自我更新能力和多向分化潜能，能向多种细胞及组织分化以修复缺损，尤其向表皮细胞的转化已被应用于创面组织的修复^{[1, 2, 3, 4]}。研究证实，小鼠或人类等不同物种的MSCs均可在一定条件下分化为表皮细胞^{[5, 6, 7, 8]}。我们既往研究发现创面组织内MSCs与创面局部骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)的高表达密切相关，两者在体内体外的定位存在关联性^[1]。骨桥蛋白又称为分泌磷酸蛋白l(secreted phos．phoprotein 1，SPP1)、骨唾液酸蛋白I(bonesialoprotein I)和尿石蛋白(urinary stone protein)，属于细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)蛋白，在血液、心肌组织、肾脏、骨骼、脑组织等不同的组织细胞中均有所发现。研究证明OPN对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞、内皮细胞等促进愈合细胞的调控发挥重要作用^[2]。OPN调控创面愈合的多个关键环节，但对MSCs向表皮细胞转化的研究很少，在创面愈合中的作用尚不明确。

本研究从野生型(WT)和OPN^-/-(KO)小鼠的骨髓分离并培养MSCs，应用已建立的MSCs表皮诱导分化体系，诱导其分化为表皮细胞；以免疫荧光、流式细胞术以及Western blot等方法检测OPN的表达与MSCs分化为表皮细胞的效率之间的关系，并通过动物实验研究OPN在MSCs向表皮细胞转化、促进创面愈合过程中的作用，为临床损伤修复提供新的理论依据与治疗手段。

雄性骨桥蛋白基因敲除(KO)小鼠(美国Jackson公司)和野生型(WT)C57/BL6小鼠(大坪医院野战外科研究所实验动物中心)，各16只，体质量20～25 g，WT-GFP-C57BL/6新生鼠用于分离培养GFP-MSCs,由大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。饲养条件:20～25 ℃，充足的水和食物。实验过程中对动物的处理符合医学伦理学标准。实验试剂:MSCs培养基(赛业广州公司)；重组HGF、IGF-I、FGF (美国Peprotech公司)，CD34-FITC、CD105-PE(美国Ebioscience公司)；兔抗小鼠单克隆CK14抗体(美国Abcam公司)等。

取KO及WT新生小鼠(鼠龄1 d)，75%乙醇浸泡5 min，冷无菌PBS冲洗，剪下四肢，剔出长骨，完全剪碎骨组织，加入BMSCs完全培养液，重悬、混匀后转移至无菌塑料培养瓶，于37 ℃，5％CO₂的恒温培养箱培养，24 h后换液去除组织块，每3～4天传代一次。

收集WT及KO两组P3细胞，计数分装于EP管内，5×10⁵/管，300×g离心5 min后100 μL PBS重悬。设置分组:空白对照、CD105-PE单染、CD34-FITC单染、CD105-PE及CD34-FITC双染(n=3)，按分组分别加入2 μL抗体，4℃孵育1 h，加入900 μL PBS，300×g室温离心5 min，弃上清加入PBS 300 μL，吹打混匀后转移至流式管内，流式细胞术检测CD105及CD34的表达情况。全蛋白提取试剂盒提取WT组和KO组MSCs的蛋白，经Western blot鉴定其OPN的表达。

取第3代WT和KO MSCs，终止消化，离心，重悬，调整细胞至1×10⁶/mL，取1 mL加入表皮转化培养体系(F12-DMEM+2%FBS +10 ng/mL IGF-I+20 ng/mL HGF+10 ng/mL b-FGF +100 U/mL青霉素+100 U/mL 链霉素)，接种于培养瓶，放入37 ℃、5% CO₂培养箱，每3 d 换液1次，每日镜下观察细胞形态变化至第17天。

收集诱导分化第12、17天的两组细胞，5×10⁵cell/管，4%多聚甲醛100 μL室温20 min，0.05%Triton 100 μL室温10 min，滴加一抗CK14(1 ∶100)40～50 μL，37 ℃ 60 min，滴加40～50 μL荧光二抗(山羊抗鼠IgG)，37 ℃ 30 min，每两步间均PBS清洗，300×g室温离心5 min。最后弃上清加入PBS 300 μL，吹打混匀后流式细胞术检测。

取第3代WT和KO MSCs，终止消化、离心、重悬、稀释形成密度为1×10⁶/mL 的液体，取100 μL置于放有细胞爬片的12孔板内，加入诱导培养体系，17 d后取出爬片，温热PBS清洗、多聚甲醛固定，3%BSA室温封闭1 h，滴加一抗CK14(1 ∶500)4 ℃过夜，滴加荧光二抗(山羊抗鼠IgG)37 ℃孵育1 h，DAPI染核，封片，立即在共聚焦显微镜下观察。

诱导分化的第17天，提取WT组和KO组的细胞总蛋白，BCA法测浓度后，8％的聚丙烯酰胺 凝胶按每孔等量30 μg上样，积层胶80 V，分离胶120 V 电泳，100V转膜90 min，转好的PVDF膜5％BSA封闭1 h，CK14(1 ∶300)、β-actin(1 ∶1 000)一抗孵育，4 ℃振荡过夜。TBST洗涤后滴加二抗(1 ∶1 000)，37 ℃孵育1 h，显影成像。Imagej分析软件扫描特异性条带净灰度值后β-actin作为内参，计算两者比值分析蛋白相对表达量。

创面模型建立:将4组小鼠以1%戊巴比妥150 μL腹腔注射麻醉，脱毛膏脱去背部毛发，勿伤及皮肤，碘伏消毒2次后，打孔器在小鼠背部形成直径0.5 cm深达筋膜层的创面^[9]。GFP-MSCs创周注射:取新生1 d的WT-GFP小鼠，培养的第3代GFP-MSCs以PBS重悬形成5×10⁵/50 μL的细胞悬液，在距离创缘0.5 cm处分别均匀注射于WT/MSCs组和KO/MSCs组小鼠，同时以等量的PBS注射于WT/PBS组和KO/PBS组小鼠作为对照。实验后1、3、5、7 d创面拍照，计算创面愈合百分率[创面愈合百分率=(初始创面面积－观察日创面面积)÷初始创面面积×100%]，并切取创面组织做组织切片免疫荧光染色检测MSCs向表皮细胞分化情况。

实验重复3次以上，数据以x ±s表示，使用SPSS 13.0统计分析软件分析，两组间比较用ｔ检验。

原代培养的细胞镜下见胞体呈多边形，较小，呈放射状集落生长；随着细胞生长，贴壁细胞逐渐增大，呈成纤维细胞样。MSCs的特征为CD105阳性，而CD34阴性。本实验MSCs的CD105阳性而CD34阴性表达率为:WT组94.04%、KO组91.57% ，鉴定结果提示培养的细胞为高纯度MSCs。Western blot结果示野生型小鼠MSCs表达OPN,而OPN^-/-小鼠MSCs不表达OPN蛋白(图 1)。

1:KO组；2:WT组 图 1 Western blot检测两组MSCs OPN蛋白的表达

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MSCs细胞贴壁生长。培养第12天部分长梭形细胞形态由梭形逐渐变扁变宽，第17天时细胞呈现出典型的铺路石样改变(图 2)，符合表皮分化的特点。

A:KO组；B:WT组 图 2 两组MSCs诱导分化第17天的形态学观察(倒置显微镜 ×100)

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WT组和KO组的细胞均有表皮细胞标记CK14 表达，表明MSCs向表皮诱导分化成功。第12天时两组表皮分化率分别为: KO组31.67%、WT组37.88%；第17天时分别为:KO组63.84%、WT组90.40%。

第17天免疫荧光检测发现，WT组和KO组的细胞均表达CK14，表明MSCs向表皮诱导分化，WT组CK14的表达阳性比率(0.936 3±0.009 5),明显高于KO组[(0.647 5±0.023 1)，(P<0.01，图 3)]。

图 3 两组MSCs诱导分化第17天CK14免疫荧光染色(激光共聚焦显微镜 ×400)

图选项

WT组CK14蛋白的表达为(0.614 6±0.015 3)，KO组(0.389 4±0.016 8)，WT组明显高于KO组(P<0.01，图 4)。

1、2:KO组；3、4:WT组 图 4 Western blot检测两组MSCs诱导分化第17天CK14的表达

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伤后1、3、5、7天创面拍照计算创面愈合百分率，以注射PBS的野生型小鼠为对照，注射PBS的敲基因小鼠创面愈合率较前者低(P<0.05)，OPN在创面愈合过程具有重要作用；同样以注射PBS的野生型小鼠为对照，注射MSCs的野生型小鼠创面愈合率较注射PBS的高(P<0.05)，注射的MSCs能够加速创面的愈合(图 5，表 1)。第3、5、7天免疫荧光染色，注射入创面内的MSCs表达表皮标志物CK14，KO/MSCs组表达弱于WT/MSCs组(P<0.05)，MSCs在创面内分化成为了表皮细胞参与创面修复(图 6，表 2)。

1、2:KO组；3、4:WT组 图 5 4组小鼠创面不同时间愈合的大体观察

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1、2:KO组；3、4:WT组 图 6 两组小鼠创面第7天CK14表达情况(共聚焦显微镜 ×200)

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大面积深度皮肤创伤、自体皮皮源十分缺乏的患者，上皮化不足是创面难以愈合的关键。研究认为，以MSCs为种子细胞，应用组织工程皮肤修复创面可以较好地解决皮源供给以及皮肤结构、功能重建等问题。MSCs经过体外扩增、纯化后仍然保持细胞的生物学特性，并能分化为多种类型的细胞^{[12, 13, 14]}。EGF 可诱导MSCs向皮肤组织分化，将两者复合移植用于猪创面缺损模型，形成的表皮层厚、角化分层明显，MSCs细胞可使经久不愈的创面表皮化，达到愈合重建^[15]。大量资料说明，MSCs能分化为表皮细胞。

OPN是在多种细胞中广泛表达的一种分泌型糖蛋白，参与细胞的多种生理病理过程。OPN高表达于创面内，趋化MSCs向创面迁移。在创面愈合的关键环节中具有多功能调控的功能，对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞、内皮细胞等促进愈合的功能调控发挥重要作用^[16]。细胞分泌OPN后，可动员骨髓MSCs增殖分化参与修复，比如分化为成纤维细胞。但是目前对此修复过程MSCs参与过程和机制的报道较少，难以 说明OPN调控MSCs的重要^[15]。本研究主要目的在于探究创面修复过程中OPN与MSCs上皮化之间的关系。

本研究发现，用MSCs的专用培养基，新生1 d的小鼠采用骨组织贴壁法培养的MSCs细胞活性好、纯度高，能够稳定传代。通过体外对野生型(WT)和OPN^-/-(KO)小鼠的MSCs进行表皮诱导，经多种方法对比分析，WT组和KO组的细胞均表达CK14，表明MSCs向表皮诱导分化，WT组表皮标志物CK14的表达阳性比率明显高于KO组，两组存在明显差异，证明了OPN基因表达降低后MSCs的表皮分化能力下降。动物实验表明敲除OPN基因后创面愈合的速度与正常小鼠相比明显减慢了。

总之，本研究发现MSCs在体内、体外可诱导分化为表皮细胞，进而促进创面愈合，OPN可能在其中发挥了重要作用，但是OPN诱导MSCs向表皮细胞分化的作用机制尚不清楚，可能为创面愈合过程中各种因素共同作用的结果。继续研究OPN诱导MSCs促进创面愈合的信号传导通路，可完善其具体机制。