乳腺癌是危及女性身心健康的恶性肿瘤之一，发病率占各种恶性肿瘤的7%~10%。调查数据显示，全球每年有120万女性罹患乳腺癌，且有50万人死于此病[1]。乳腺癌发生远端转移是乳腺癌患者主要的致死原因，但乳腺癌转移的具体机制目前尚未明确。
miRNA是一类长度为18~24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，它们参与了人类基因组中约1/3 左右基因的表达调控。在细胞增殖、分化、凋亡，应激反应，新陈代谢等多种生命过程中发挥着重要作用[2]。近50%已知的miRNAs位于与肿瘤相关的基因区域/脆性位点，提示 miRNA 可作为致癌或抑癌基因而发挥促癌或抑癌作用[3]。miRNA 在乳腺癌中参与肿瘤细胞的生长、凋亡、迁移、侵袭等肿瘤发生、发展过程，进而实现对乳腺癌转移的调控。最近研究发现microRNA-335(miR-335)在结肠癌、儿童急性粒细胞性白血病及星形细胞瘤中呈现高表达[4, 5, 6]，而在乳腺癌、胃癌中miR-335是低表达的[7, 8]。这说明miR-335在不同的肿瘤中发挥着不同的作用。为了探讨miR-335在乳腺癌中的具体作用机制，本研究利用荧光实时定量PCR检测miR-335在乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系中的表达。进一步利用miR-335模拟物(mimics)转染 MDA-MB-231 细胞，观察其对该细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响，并探讨miR-335可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料各乳腺癌细胞株与人乳腺正常上皮细胞MCF-10A均来源于ATCC并由本实验室保存。20例原发性及淋巴结转移的乳腺癌组织均来源于重庆市肿瘤医院。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、OPTI-MEM培养基及胎牛血清(Gibco公司，美国)，马血清(Invitrogen 公司，美国)，氢化可的松、生长因子(EGF)及胰岛素(Invitrogen 公司，美国)，霍乱毒素(Sigma 公司，美国)，青链霉素(碧云天公司，上海)。RNA 抽提试剂(TRIzol，TaKaRa 公司，日本 )。miR-335 mimics和对照mimics control由上海吉玛公司合成。Lipofect-amine 2000(Invitrogen公司，美国)。Transwell小室(Costar公司，美国)。3-(4，5-二甲基噻唑－2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、二甲基亚砜(DMSO)、结晶紫(台盼蓝)染液(Sigma公司，美国)，SYBRGreen PCR Master Mix(TOYOBO公司，日本)。蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和ECL发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人MMP-2和MMP-9多克隆抗体购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体IgG购自北京中杉生物有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231采用含 10％FBS高糖DMEM培养基；SKBR-3、T47D和BT-474采用含10%FBS 的RPMI1640培养 基；MCF-10A采用DMEM/F12含5 %马血清、10 μg/mL 胰岛素、20 ng/mL EGF、100 ng/mL霍乱毒素、0.5 μg/mL 氢化可的松培养基，37 ℃、5%CO 2及相对湿度条件下培养。
1.2.2 细胞RNA提取收集5×10 6 细胞，加入1 mL TRIzol重悬并反复吹打使细胞充分裂解 ，以备抽提RNA使用 。 每1毫升 TRIzol 加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀 30 s，室温静置 15 min，4 ℃下12 000×g 离心15 min。小心转移上层水相于另一RNase free EP中，加入500 μL 异丙醇轻柔地颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃下12 000×g离心20 min，弃上清液 ，加入1 mL 80%乙醇洗涤，4 ℃下12 000×g离心 20 min弃上清。 超净台下风干。加入适量 DEPC 水溶解，分光光度计测定浓度，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性后于-80 ℃保存备用。
1.2.3 组织RNA提取临床收集液氮冻存的20例原发性及淋巴结转移的乳腺癌组织，放入研钵中，加入液氮研磨，每50 mg组织加入1 mL TRIzol，转入RNase free EP管。12 000×g离心5 min，弃沉淀。 每1 mL TRIzol 加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀 30s，室温静置 15 min，4 ℃下12 000×g 离心15 min。小心转移上层水相于另一RNase free EP中，加入500 μL 异丙醇轻柔地颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃下12 000×g离心20 min，弃上清液 ，加入1 mL 80%乙醇洗涤，4 ℃下12 000×g离心20 min弃上清。 超净台下风干。加入适量 DEPC 水溶解，分光光度计测定浓度，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性后，于-80 ℃保存备用。
1.2.4 反转录-实时荧光定量PCRmiRNA的反转录-实时定量多聚酶链反应(qRT-PCR)采用茎环法。miR-335 的反转录引物为 5′-GTCGTATCCAGTGCA-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACTCAACATC-3′，荧光定量 PCR miR-335 的上游引物为 5′-TAGCTTATCAGACTG-A-3′，下游引物为 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。 将抽提的RNA进行反转录，实时定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix(Toybo公司，日本)和96孔荧光定量PCR仪 (Bio-Rad 公司，美国)。采用U6 RNA作为内参。每个样本重复3次实验后得到的数据，通过比较 CT值法(2-△△Ct)进行相对定量分析。
1.2.5 细胞转染对数生长期MDA-MB-231 细胞于转染前24 h接种于6孔板中(3×105／孔)，培养至细胞达 60%融合度时进行细胞转染。按照 Invitrogen 公司的操作说明将 100 pmol miR-335-mimics 转染到MDA-MB-231细胞中，转染mimics control组为阴性对照。37 ℃、5％CO 2 培养箱中继续培养进行相关检测。
1.2.6 MTT 实验转染后24 h,将细胞以每孔 1×104的密度接种于96孔板中，每组4个复孔，于不
同时间点即1、 2、 3、 4、 5、6、7 d，每孔加MTT 20 μL(5 mg/mL)，置37 ℃、5% CO2孵箱继续培养4 h。取出培养板，轻轻吸去上清液，每孔加100 μL DMSO终止反应并溶解甲赞蓝紫色颗粒，震荡混匀，分光光度计测各孔D(490)值，计算平均值。实验重复 3次。
MDA-MB-231细胞转染48 h 后收集，用PBS悬浮细胞，1 000 r/min离心5 min；重复3次，弃上清培养基； 最后加入1 mL PBS混匀并转移至1.5 mL EP管中,加入5 μL Annexin-FITC，轻轻振荡混匀后于4 ℃下孵育15 min，之后加入5 μL碘化丙啶(PI)，4 ℃下孵育5 min，流式细胞仪上进行检测并分析细胞凋亡情况。
1.2.8 Transwell 迁移实验每个处理组细胞浓度为 1×104／mL，每个Transwell小室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL 条件培养基(含有10％FBS)，置于 37℃、5％CO2培养箱培养。 每个处理组设3个复孔。培养24 h后取出 Transwell小室，吸弃小室内的液体，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。用4%多聚甲醛固定Transwell小室反面的细胞30 min。放入结晶紫染液中，染色15 min。200倍镜下观察并拍照，随机选取3个视野计数，取均数作为透膜细胞数。
1.2.9 Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达MDA-MB-231细胞经转染处理48 h后，收集各组细胞，提取蛋白，BCA法定量。取40 μg蛋白样 品，经SDS-PAGE分离后,电转移至PVDF 膜上，经 5% 脱脂奶粉室温封闭2 h；加入兔抗人MMP-2 (1 ∶1 000 稀释) 抗体，相对分子质量74×103，MMP-9 (1 ∶1 000稀释)抗体，相对分子质量92×103，兔抗人 β-actin 多克隆抗体 ( 1 ∶1 000)，相对分子质量43×103。4 ℃过夜，TBST洗膜3次,再分别与HRP标记的山羊抗兔二抗( 1 ∶3 000)室温孵育2 h，ECL化学发光。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料用x±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，2组均数比较采用配对t检验。
2 结果 2.1 miR-335 在乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系中的表达乳腺癌细胞系BT474、T47D、 MCF-7、SK-BR-3、 MDA-MB-231中miR-335表达水平低于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A，在MDA-MB-231细胞中表达最低(P<0.01，图 1)。
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| a：P<0.01,与正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较 图 1 qRT-PCR检测miR-335 在乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中的表达 |
对提取的10对原发性及淋巴结转移的乳腺癌组织RNA随机配对进行荧光实时定量PCR，检测结果显示淋巴结转移性乳腺癌组织中miR-335表达水平(1.139±0.052)低于原发性乳腺癌组织(3.318±0.088，P<0.05)。
2.3 实时定量PCR验证转染效果为确定miR-335-mimics 是否成功转染MDA-MB-231细胞，在转染24 h 后，用荧光实时定量PCR 相对定量的方法检测 miR-335 的表达，结果发现miR-335-mimics 转染组miR-335的表达较 2个对照组明显升高 [(124.710±6.493) vs (1.039±0.189)、(1.163±0.115)，P<0.01]，该结果表明瞬时转染成功，后继实验可以采用miR-335-mimics 转染24 h的细胞进行分析。
2.4 miR-335 对 MDA-MB-231 细胞增殖能力的影响与空白对照组和阴性对照组相比，miR-335组的 MDA-MB-231细胞增殖能力没有发生明显变化(P>0.05，图 2)。
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| 图 2 MTT检测过表达miR-335对MDA-MB-231细胞增殖功能的影响 |
流式细胞仪检测结果显示：与空白对照组和阴性对照组比较，miR-335组的 MDA-MB-231细胞凋亡率没有发生明显变化(P>0.05,图 3)。
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| A：空白对照组；B：阴性对照组；C：miR-335组；D：细胞凋亡率分析 图 3 流式细胞仪检测过表达miR-335对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 |
MDA-MB-231细胞转染miR-335 mimics后24 h，细胞穿过小室聚碳酸酯膜的数目(34.7±3.5)明显低于阴性对照组(84.3±2.5)和空白对照组(78.3±3.1，P<0.05,图 4)。
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| A：空白对照组；B：阴性对照组；C: miR-335组；D：穿膜数分析 a：P<0.05，与miR-335组比较 图 4 Transwell迁移实验观察miR-335 对 MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 |
Western blot检测结果显示：miR-335组MMP-2和MMP-9的蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(图 5)。
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| 1：空白对照组；2：阴性对照组；3：miR-335组 图 5 Western blot检测各组细胞 MMP-2(A)、MMP-9(B)表达 |
miRNA是目前哺乳动物细胞研究最成熟的非编码RNA，是近几年来分子生物学领域的又一个研究热点。miRNA对靶基因的调控主要通过与其mRNA 3′UTRs (untranslated regions) 区近乎完全互补结合后在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，在细胞增殖、分化、凋亡、应激反应、新陈代谢等许多生命过程中发挥着重要作用。这些进程的失调通常发生在肿瘤中，与致癌关系密切。 第一个被发现miRNAs与肿瘤相关的是在B细胞慢性淋巴白血病中染色体13q14.3的异位诱导缺失[9]。miR-15a 和 miR-16-1在此位点的丢失导致了抗凋亡基因Bcl-2的高表达。大量的研究证明异常的miRNA存在人类肿瘤中，包括乳腺癌。如miR-196 和 miR-10a位于同源异形框与乳腺癌的发展和致癌有关[10]。miR-125b在乳腺癌中低表达，位于染色体11q23-24,其中一个区域在乳腺癌、卵巢癌、肺癌中经常发生丢失[11]。
乳腺癌转移相关miRNA的发现，为我们研究乳腺癌转移提供了新的思路。Ma 等[12]最早发现 miR-10b 在乳腺癌中具有侵袭和转移的作用，miR-10b可通过抑制转录因子 homeoboxD10 (HOXD10) 的翻译，引发转移基因 ras homologue gene family member C(RHOC) 的表达，其能够促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。Wu等[13]发现 miR-340 在侵袭转移能力强的乳腺癌细胞系中表达下调，诱导miR-340 的表达能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。近年来研究发现 miR-335 在不同的肿瘤中发挥着不同的作用，miR-335在乳腺癌、胃癌中低表达[7, 8] ，而在星形细胞瘤、非小细胞肺癌中miR-335 高表达，并能促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力[4, 6, 14]。本研究在乳腺癌细胞水平对miR-335进行荧光实时定量PCR检测，结果发现miR-335在所选的乳腺癌细胞株中均呈低表达，尤其是高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达更低，与文献[7]报道一致。为了进一步验证miR-335在乳腺癌中的表达情况，本研究收集了20例原发性乳腺癌和淋巴结转移性乳腺癌临床组织标本，采用荧光实时定量PCR检测miR-335的表达，结果发现20例随机配对标本中有7例淋巴结转移性乳腺癌中miR-335的表达低于原发性乳腺癌。因此推测miR-335可能在乳腺癌中发挥类似抑癌基因的作用，尤其与乳腺癌的转移有关。进一步在低表达miR-335的乳腺癌细胞系MDA-MB-231过表达miR-335，通过细胞增殖、细胞凋亡和迁移实验探讨miR-335对乳腺癌细胞的生物学行为的影响。结果显示：过表达miR-335对MDA-MB-231细胞的增殖能力与对照组相比无明显变化，对细胞凋亡也没有明显的影响，但对MDA-MB-231细胞的迁移能力却起到了明显抑制作用。有研究已证实Sp1、Bcl-w是胃癌中miR-335发挥作用的靶基因。高表达的Bcl-w与胃癌的浸润显著相关[15]，Bcl-w可以通过激活PI3K/Akt传导通路来促进胃癌细胞浸润。而miR-335不仅可以直接抑制Sp1的表达，而且还可以通过抑制Bcl-w的表达来抑制其介导的PI3K-Akt-Sp1通路抑制Sp1的表达，进而达到抑制胃癌细胞侵袭转移的目的。2008年Tavazoie等[7]在对乳腺癌细胞株MDA-MB-231研究中发现miR-335通过作用于转录因子SOX4和细胞外基质成分tenascin C(TNC)来抑制肿瘤的迁徙和转移。转录因子SOX4则是通过与Wnt信号通路、TGF-β、Notch、Hedgehog、P53及自身的转录因子作用等途径综合调控特定靶基因的表达，在细胞的发育和迁移等方面发挥重要的作用[16]。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一种与肿瘤侵袭和转移密切相关的蛋白酶，尤其是胶原酶(MMP-2)和明胶酶(MMP-9)与之关系最为密切[17]。被激活后一方面降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质和基底膜,使瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，促进肿瘤侵袭和转移；另一方面则通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤侵袭和转移[18, 19]。研究表明，MMP-2和MMP-9在星形细胞瘤、肺癌、肾细胞癌及乳腺癌等多种肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的浸润和转移中起到重要作用。本研究发现过表达miR-335后MMP-2和MMP-9的表达在蛋白水平均下降，我们推测miR-335抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力与下调MMP-2和MMP-9的表达有关，但miR-335直接靶定MMP-2和MMP-9还是通过靶定其他基因后引起MMP-2和MMP-9的表达下调还需进一步探索。
本研究初步探明了miR-335对乳腺癌生物学行为的影响，为临床治疗乳腺癌开辟了新的方案并奠定了理论基础。深入透彻地研究miR-335在乳腺癌中作用机制，将使miR-335有望成为诊断乳腺癌发生转移的新的生物学指标和治疗靶点。有关miR-335对乳腺癌迁移的具体作用机制，本课题组仍在进一步研究。
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