2 全军临床病理学研究所
2 Institute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
肝细胞癌发病率目前在所有肿瘤发病率中处于第6位,其致死率位居第3。肝细胞癌经各种治疗后复发转移率高已成为临床亟待解决的问题[1, 2]。慢性炎症、病毒感染及长期肝纤维化和肝硬化状态是已被公认的肝细胞癌复发的重要危险因素[3]。目前最新的观点认为,在肿瘤的发生、发展过程中神经系统的支配及其对肿瘤组织的营养作用必不可少[4]。迷走神经在内脏器官中分布极其广泛,是支配肝脏的主要神经之一,在肝脏的病理生理过程中发挥着相当重要的调控作用[5]。P物质是迷走神经感觉纤维末梢所释放的主要神经递质,具有调控免疫反应和肿瘤发生发展的作用[6]。然而对于迷走神经在肝细胞癌发生发展过程中所起的作用,尤其是其感觉神经纤维末梢所释放的P物质对肝癌细胞生物学功能的影响及其可能的分子机制还少见报道。本研究旨在证实迷走神经递质P物质对人类肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响,并探讨其可能的分子机制,以期为临床开创新的肝细胞癌治疗方式提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器
P物质(美国Sigma公司),兔抗人N-Cadherin多抗和兔抗人Slug多抗(Epitomics公司),兔抗人NK-1受体多抗(Santa Cruz公司),小鼠抗人E-Cadherin多抗(Abcam公司),兔抗人GAPDH多抗(BioVision公司),辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗(中杉金桥生物技术公司),RNA提取试剂TRIzol、反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司),CellTiter Blue细胞增殖活性检测试剂盒(美国Promega公司),Metrigel生物基质胶(美国BD公司),DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司),Transwell小室(美国Millipore公司)。实时荧光定量PCR仪、蛋白质凝胶电泳、电转系统、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),紫外分光光度计(美国Themo Fisher公司)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养
实验所使用的人肝癌细胞株HepG2 和SMMC-7721来源于美国ATCC细胞库。两种细胞均培养在含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中。细胞培养箱内培养条件设置为恒温37℃,恒定5%CO2浓度。每隔2天换液,对数生长期传代。 1.2.2 细胞RNA提取、反转录及实时定量荧光PCR
取1~5×106个细胞,用TRIzol提取细胞总RNA,检测其纯度、浓度和完整性后,反转录为cDNA并进行实时荧光定量PCR检测。10 μL反应体系如下配制:0.5 μL cDNA+0.4 μL前引物+0.4 μL后引物+5 μL SYBR+3.7 μL无酶水配制成。按如下反应条件扩增45个循环:95 ℃解链30 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸30 s。其中以无酶水代替cDNA模板作为阴性对照,以扩增GAPDH作为阳性对照。用Bio-Rad CFX Manager软件对两种细胞NK-1受体表达进行定量分析。取各扩增产物2 μL在1%琼脂糖凝胶上电泳定性检测分析PCR扩增产物长度与预期产物长度的一致性。PCR反应体系中以无酶水代替cDNA模板作为阴性对照,扩增GAPDH作为阳性对照及内参照。所用引物序列及预计扩增产物长度见表 1。
引物名称 | 序列 | 预计产物长度 |
NK-1受体 | 上游:5′-AGGTTCCGTCTGGGCTTCAA-3′ | 134 bp |
下游:5′- TCCAGGCGGCTGACTTTGTA-3′ | ||
GAPDH | 上游:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′ | 258 bp |
下游:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′ |
取对数生长期的SMMC-7721和HepG2细胞消化、离心后制成单细胞悬液。在流式细胞仪下按300个细胞/孔,接种到96孔细胞培养板中。设置P物质浓度梯度:0、100、250、500 nmol/L。每种细胞每个药物浓度设3个复孔,含10%FBS的DMEM培养基(不含细胞)作为空白对照。分别于0、24、48、72、96、120 h 在避光条件下,向每次所要检测的孔中,每孔加入100 μL检测试剂(CellTiter Blue ∶含10%FBS的DMEM培养基=1 ∶9)。将细胞培养板放入培养箱中恒温37 ℃,恒定5%CO2浓度继续培养2 h后,用酶标仪以560 nmol/L波长激发荧光并于590 nmol/L波长处检测每孔光密度值。每组取3个复孔的均值及标准差作为统计量进行分析。 1.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭能力分析
实验组SMMC-7721和HepG2细胞经100 nmol/L P物质预处理48 h后,将含有5×104个细胞的DMEN细胞悬液300 μL加入未经Metrigel生物基质胶包被的小室中,检测细胞迁移能力;加入经Metrigel生物基质胶包被的小室中,检测细胞侵袭能力。在相应培养孔中加入含30%胎牛血清的DMEM细胞培养液1 100 μL,并于小室及相应培养孔中均加入P物质,调整浓度为100 nmol/L。用等体积PBS代替P物质,在相同条件下处理细胞作为对照组。各组在细胞培养箱中恒温37℃,恒定5%CO2浓度,让检测迁移能力的细胞穿膜24 h,而检测侵袭能力的细胞穿膜48 h。取小室固定染色后充分拭去小室内面的细胞。在×100光学显微镜下每个小室随机取3个视野进行拍照,并对每个视野中的细胞进行计数,计算各小室所对应视野中细胞数均值及标准差作为统计量进行分析。 1.2.5 细胞蛋白质提取及Western blot检测
取1~5×106个细胞提取细总蛋白,用RCDC法测定各组样品中蛋白质浓度。各组蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶中充分电泳后电转至NC膜上。5%脱脂牛乳封闭NC膜2 h,用兔抗人NK-1受体多抗(1 ∶500稀释)、兔抗人N-Cadherin多抗(1 ∶1 000稀释)、小鼠抗人E-Cadherin 多抗(1 ∶1 000稀释)、兔抗人Slug多抗(1 ∶1 000稀释)和兔抗人GAPDH(1 ∶1 000稀释)于4℃下孵育相应NC膜条带8 h,洗涤后用辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀释)室温孵育2 h,用ECL在凝胶成像系统中显影。用Quantity One软件测量蛋白质条带进行灰度值。各组按下列公式(相对表达量=目的条带灰度值/对应 GAPDH灰度值)计算后对目的蛋白进行半定量分析。 1.3 统计学分析
用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据采用x±s 表示,两组非配对数据均值间比较采用独立样本t检验。 2 结果 2.1 人类肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中均有NK-1受体表达
经实时荧光定量PCR检测发现:HepG2和SMMC-7721细胞中均扩增出NK-1受体基因的目的片段,阴性对照组无目的片段扩增,而阳性对照组可扩增出GAPDH基因片段。根据琼脂糖凝胶电泳分析,PCR扩增产物长度与预计扩增产物长度一致,其中NK-1受体扩增产物片段长度约为130 bp,GAPDH扩增产物片段长度约为260 bp(图 1),且扩增产物融解曲线为单峰,证明PCR扩增目的片段为NK-1受体基因片段。
2.2 P物质短期内不影响HepG2和SMMC-7721细胞的增殖能力为了探讨P物质是否影响人肝癌细胞的增殖能力,用不同浓度的P物质(0、100、250、500 nmol/L)分别对HepG2和SMMC-7721两种细胞进行处理并对其增殖能力进行检测。表 2、3示两种细胞在前96 h,实验组(P物质浓度为100、250、500 nmol/L)与对照组(P物质浓度为0 nmol/L)相比,增殖能力未见明显变化,无显著统计学差异(P>0.05)。而在120 h较高浓度的P物质(250 nmol/L和500 nmol/L)具有抑制两种细胞增殖的趋势(P<0.05)。证明在96 h内各种浓度的P物质对两种人肝癌细胞的增殖能力不产生影响。
0 nmol/L | 100 nmol/L | 250 nmol/L | 500 nmol/L | |
0 h | 119.55±2.05 | 119.61±2.37 | 117.95±2.06 | 120.17±3.07 |
24 h | 219.06±16.15 | 200.92±1.43 | 217.43±7.57 | 213.63±5.48 |
48 h | 400.70±16.35 | 437.68±58.00 | 408.62±12.03 | 355.62±49.86 |
72 h | 689.13±132.05 | 819.31±90.78 | 694.64±160.69 | 858.80±62.30 |
96 h | 1 436.36±301.57 | 1 464.02±90.92 | 1 288.35±73.05 | 1 248.21±156.30 |
120 h | 2 321.79±210.42 | 1 975.57±13.98 | 1 658.49±54.43 | 1 658.40±68.21 |
0 nmol/L | 100 nmol/L | 250 nmol/L | 500 nmol/L | |
0 h | 142.50±1.93 | 144.35±2.20 | 144.96±1.25 | 143.63±1.28 |
24 h | 220.03±10.37 | 221.65±3.92 | 233.62±4.73 | 222.88±2.99 |
48 h | 382.09±21.22 | 382.83±12.99 | 420.79±25.05 | 356.70±19.20 |
72 h | 545.80±37.20 | 563.79±24.58 | 508.47±33.87 | 519.51±16.61 |
96 h | 766.71±6.52 | 841.08±71.11 | 774.17±13.74 | 785.74±62.33 |
120 h | 1 294.62±90.58 | 1 164.99±33.03 | 1 044.78±36.59 | 934.83±27.69 |
进一步探讨P物质对人肝癌细胞侵袭转移能力的影响,在100 nmol/L浓度的P物质作用下对HepG2和SMMC-7721细胞进行Transwell迁移和侵袭实验。各组在光学显微镜下随机取3个视野进行分析,发现实验组细胞的迁移(图 2A、C)和侵袭(图 2B、D)穿膜能力均较对照组明显增加。对所取视野中的细胞计数,分析发现实验组穿膜细胞数与对照组相比均具有显著统计学差异(P<0.05,表 4)。说明P物质能够促进人肝癌细胞迁移和侵袭。
组别 | 迁移实验(个/视野) | 侵袭实验(个/视野) |
HepG2 | ||
对照组 | 70.33±6.36 | 65.33±15.78 |
实验组 | 250.00±11.15 | 212.00±7.64 |
SMMC-7721 | ||
对照组 | 176.00±5.03 | 128.00±17.62 |
实验组 | 355.70±14.05 | 219.70±8.09 |
为了探讨P物质促进人肝癌细胞迁能和侵袭能力的分子机制,用100 nmol/L P物质处理SMMC-7721和 HepG2两种细胞48 h后提取细胞总RNA和蛋白质,分别用RT-PCR和Western blot检测细胞中NK-1受体表达变化;并用Western blot检测上皮-间质转化蛋白质标志的表达情况。发现经P物质处理后,两种细胞中的NK-1受体表达在mRNA水平(表 5)和蛋白质水平(图 4)均较对照组明显上调(P<0.05)。同时,上皮样细胞标志蛋白质E-Cadherin表达量较对照组细胞明显下调,而间质样细胞标志蛋白质N-Cadherin及E-Cadherin抑制蛋白Slug的表达明显上调(图 3A、C)。进行半定量分析发现上述3种目的蛋白在实验组中的表达量与对照组相比具有显著统计学差异(P<0.05,图 3B、D)。
3 讨论
迷走神经递质P物质作为速激肽家族的成员之一,包含11个氨基酸残基,主要由感觉神经纤维分泌,是重要的感觉神经递质[7, 8]。在疼痛和慢性炎症等方面发挥重要的生理功能[8]。最近的研究发现,在前列腺癌发生转移的过程中,新生迷走神经的参与十分关键[9]。另外,在胰腺癌中,普遍存在的肿瘤噬神经生长现象与迷走神经感觉纤维末梢所释放的P物质及NK-1受体有密切关系[10]。肝脏中的感觉神经纤维 由迷走神经发出,所以肝脏中的P物质主要由迷走神经末梢释放。但在肝细胞癌中,迷走神经感觉纤维末梢通过释放P物质,对疾病进展的影响尚待进一步研究。
本研究发现HepG2和SMMC-7721两种人类肝癌细胞中均表达NK-1受体。经100 nmol/L P物质作用48 h后,上述两种人类肝癌细胞的迁移和侵袭能力明显增强,NK-1受体表达也显著升高,且其表达的上皮样细胞标志蛋白E-Cadherin下调,而间质样细胞标志蛋白N-Cadherin及E-Cadherin抑制蛋白Slug表达上调。说明在此过程中,P物质既上调了人类肝癌细胞中的NK-1受体,也有效促进了其发生上皮-间质转化(EMT)。另外 ,在0、100、250、 500 nmol/L浓度梯度的P物质作用下,实验所使用的两种人类肝癌细胞增殖 能力在短期(96 h)内未受影响,且低浓度(100 nmol/L) P物质对细胞增殖的作用相对更小。基本可以排除细胞增殖在48 h内对细胞迁能和侵袭功能检测产生影响。
P物质主要通过与神经激肽受体结合后发挥作用。在众多神经激肽受体中P物质与NK-1受体亲合力最高,因此NK-1受体也被称为P物质受体[7, 11]。NK-1受体属于七次跨膜的G蛋白藕连受体[12],可以通过G蛋白调控β-arrestin分子活性[13],进一步激活下游PKC/ERK/JNK/MAPK等信号通路[14],也可通过G蛋白α亚基激活PKA,调节环磷酸腺苷反应物结合蛋白(CREB)活性,进而调控细胞侵袭转移相关基因的表达,增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。目前也有研究发现P物质与NK-1受体结合后,可在肿瘤组织中上调NK-1受体,并通过激活下游信号通路促进肿瘤增殖、血管生成和侵袭转移[15, 16]。结合本研究的结果,可以推断:迷走神经末梢所释放的P物质与肝癌细胞中表达的NK-1受体结合,在上调NK-1受体的同时,激活细胞内下游信号分子,调控细胞侵袭转移相关基因表达,促进细胞发生EMT,进而增强肝癌细的迁移和侵袭能力。
随着当今社会医疗水平的不断提高,及生物-心理-社会医学模式的提出,医学界普遍认同心理因素对身体疾病的发生、发展过程会产生不可忽视的影响,而神经调控在这当中起到了至关重要的作用。已有研究者发现手术切除迷走神经或用辣椒素化学性失活迷走神经感觉神经纤维后乳腺癌的转移能力被提升[17, 18],而用塞马莫德刺激迷走神经后,可以抑制乳腺癌转移[6]。迷走神经不但可以释放P物质,也能够调控组织中可以水解P物质而产生P物质片段的脑啡肽酶和金属肽酶水平[17]。完整的P物质可以促进肿瘤细胞增殖和迁移[10, 13, 16],而一些P物质水解片段却发挥着抗炎和抗肿瘤的作用[19]。另外,目前已有研究证明一些P物质类似物可以与P物质相拮抗而产生抗癌效应[20]。所以基于本研究的结论,对于肝细胞癌而言,是否可以通过药物或其他方式调节迷走神经兴奋性,进而调整肝脏中P物质、脑啡肽酶等水解P物质的酶类以及P物质水解片段含量而起到防治肝癌的作用,将是今后进一步研究的方向。
[1] | Forner A, Llovet J M, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2012, 379(9822): 1245-1255. |
[2] | Ferlay J, Shin H R, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917. |
[3] | Alazawi W, Cunningham M, Dearden J, et al. Systematic review: outcome of compensated cirrhosis due to chronic hepatitis C infection[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2010, 32(3): 344-355. |
[4] | Chedotal A, Kerjan G, Moreau-Fauvarque C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers[J]. Cell Death Differ, 2005, 12(8): 1044-1056. |
[5] | Jensen K J, Alpini G, Glaser S. Hepatic nervous system and neurobiology of the liver[J]. Compr Physiol, 2013, 3(2): 655-665. |
[6] | Erin N, Duymus O, Ozt rk S, et al. Activation of vagus nerve by semapimod alters substance P levels and decreases breast cancer metastasis[J]. Regul Pept, 2012, 179(1/3): 101-108. |
[7] | Hokfelt T, Pernow B, Wahren J. Substance P: a pioneer amongst neuropeptides[J]. J Intern Med, 2001, 249(1): 27-40. |
[8] | Harrison S, Geppetti P. Substance p[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2001, 33(6): 555-576. |
[9] | Magnon C, Hall S J, Lin J, et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression[J]. Science, 2013, 341(6142): 1236361. |
[10] | Li X, Ma G, Ma Q, et al. Neurotransmitter substance P mediates pancreatic cancer perineural invasion via NK-1R in cancer cells[J]. Mol Cancer Res, 2013, 11(3): 294-302. |
[11] | Steinhoff M S, von-Mentzer B, Geppetti P, et al. Tachykinins and their receptors: contributions to physiological control and the mechanisms of disease[J]. Physiol Rev, 2014, 94(1): 265-301. |
[12] | Pennefather J N, Lecci A, Candenas M L, et al. Tachykinins and tachykinin receptors: a growing family[J]. Life Sci, 2004, 74(12): 1445-1463. |
[13] | Lang K, Drell T L 4th, Lindecke A, et al. Induction of a metastatogenic tumor cell type by neurotransmitters and its pharmacological inhibition by established drugs[J]. Int J Cancer, 2004, 112(2): 231-238. |
[14] | Heasley L E. Autocrine and paracrine signaling through neuropeptide receptors in human cancer[J]. Oncogene, 2001, 20(13): 1563-1569. |
[15] | Munoz M, Covenas R. Neurokinin-1 receptor: a new promising target in the treatment of cancer[J]. Discov Med, 2010, 10(53): 305-313. |
[16] | Friess H, Zhu Z, Liard V, et al. Neurokinin-1 receptor expression and its potential effects on tumor growth in human pancreatic cancer[J]. Lab Invest, 2003, 83(5): 731-742. |
[17] | Erin N, Zhao W, Bylander J, et al. Capsaicin-induced inactivation of sensory neurons promotes a more aggressive gene expression phenotype in breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res Treat, 2006, 99(3): 351-364. |
[18] | Erin N, Akdas-Barkan G, Harms J F, et al. Vagotomy enhances experimental metastases of 4THMpc breast cancer cells and alters substance P level[J]. Regul Pept, 2008, 151(1/3): 35-42. |
[19] | Sakurada C, Watanabe C, Sakurada T. Occurrence of substance P(1-7) in the metabolism of substance P and its antinociceptive activity at the mouse spinal cord level[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2004, 26(3): 171-176. |
[20] | MacKinnon A C, Waters C, Jodrell D, et al. Bombesin and substance P analogues differentially regulate G-protein coupling to the bombesin receptor. Direct evidence for biased agonism[J]. J Biol Chem, 2001, 276(30): 28083-28091. |