2400016 重庆,重庆医科大学:附属第一医院肝胆外科
2Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400016,China
我国是肝癌高发国,发病率和病死率均居世界之首。目前,以手术治疗为主的综合治疗模式在一定程度上使肝癌的远期疗效得到改善[1]。但手术后的高复发率仍然是亟待解决的难题[2]。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤细胞中少部分具有自我更新、无限增殖能力和多分化潜能的细胞亚群,是肿瘤的复发和转移的根源[3, 4, 5, 6]。随着肿瘤干细胞理论的提出,人们对肝癌的治疗有了新的认识。在最近研究[7]中发现,在许多实体肿瘤中存在肿瘤干细胞,他们分别有各自不同的肿瘤标记物。其中人CD133在卵巢上皮癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤的干细胞中表达[8]。放射免疫疗法(radio immunotherapy,RIT)是利用放射性标记的抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)同时与限量的特异性抗体(Ab)进行竞争性免疫结合反应[9],使肿瘤组织内积聚大量的放射性核素,实现对肿瘤靶向照射的一种肿瘤治疗方式。上皮间质转化[10](epithelial mesenchymal transition,EMT)是指细胞逐渐丧失了上皮细胞的特性而获得了间质细胞的特性,并表现出细胞迁移能力的增强,而E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白表达的变化,是目前国际公认细胞发生EMT的分子标志物[11]。最近研究发现EMT的过程是可逆的[12],即间质-上皮逆转分化(mesenchymal epithelial transition,MET)。MET将可能诱导肿瘤干细胞分化为肿瘤细胞,降低其抵抗放化疗的能力,为临床治疗肝癌提供新的实验依据。结合本课题前期研究实验结果[13],选用CD133为肝癌干细胞分选标记物并设计131I标记CD133mAb特异性作用于CD133+肝癌干细胞并检测其侵袭能力以及MET特异性生物学标记物E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的改变。
1 材料与方法 1.1 试剂人肝癌HepG2细胞(实验室保存);胎牛血清、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)细胞培养基、DMEM/F12(1 ∶1)细胞培养基(GIBCO BRL,美国);CD133MicroBead-Kit抗体、阻断受体阻滞剂FCR试剂盒分离(德国Miltenyi Biotec公司购买);CD133 MicroBead、CD133/2-PE流式抗体;雌雄各半SPF级4~6周龄BALB/c裸鼠,体质量20~25 g,购自重庆医科大学实验动物中心[动物证书号:SCXK(京)2009-2007]。Na131I由重庆医科大学第一附属医院核医学科提供;氯胺-T(天津天台精细化学品公司);CD133mAb(美国ImmunoWay公司);碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、牛血清蛋白(BSA)及胰岛素(美国PeproTech公司);E-钙粘蛋白抗体,N-钙粘蛋白,波形蛋白(宜康);蛋白提取试剂盒(碧云天生物公司)。
1.2 方法 1.2.1 HepG2肝癌细胞株的培养与传代HepG2用含150 mL/L FBS 的DMEM培养基,5%CO2、37 ℃恒温、饱和稳定湿度的孵箱中培养至对数生长期后,进行后续实验。
1.2.2 CD133+HepG2肝癌干细胞的分离从108数量级对数生长的细胞中进行免疫磁珠分选,根据MACS操作分离说明:①细胞在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后再经过胰酶消化之后,磁珠分选试剂盒缓冲液(buffer)洗涤,重悬,300×g离心10 min,去上 清液。②300 μL 缓冲细胞悬液,加入100 μL受体拮抗剂,紧接着加入100 μL CD133免疫磁珠(MicroBeads),充分混合均匀后密封并放入4 ℃ 冰箱孵育30 min。③加入1~2 mL磁珠分选试剂盒缓冲液(buffer)清洗细胞,300×g离心10 min,完全除去上清液。④用磁珠分选试剂盒buffer重新吹打细胞至500 μL。⑤摆放磁珠分选架、磁珠分选器、滤柱,加入500 μL 缓冲液润洗滤柱。⑥将预先制备的HepG2细胞通过滤柱收集,分别收集CD133-HepG2细胞和CD133+HepG2细胞并计数。将得到的CD133+细胞放入提前准备好的含有EGF 40 ng/mL、FGF 20 ng/mL、BSA 4%、胰岛素10 mg/mL 的DMEM/F12(1 ∶1)细胞培养基中培养。
1.2.3 流式检测HepG2细胞的CD133表达率将HepG2细胞、CD133+细胞分别悬浮,将悬浮好的HepG2细胞、CD133+HepG2细胞分别加入到1×107/80 μL流式分选缓冲液。加入20 μL FCR 阻断剂;加10 μL CD133/2抗体,充分混合均匀后密封并放入4 ℃ 冰箱孵育20 min;添加1~2 mL缓冲液/107个细胞,300×g离心10 min,适量缓冲液重悬细胞,用流式细胞仪检测。
1.2.4 成球实验将CD133-和CD133+HepG2细胞以1×106/孔接种在6孔板中,分别用无血清DMEM/F12含生长因子的培养基,在5%二氧化碳37 ℃ 的饱和湿度在孵化器孵化,每隔3 d换液1次,培养第7天观察CD133-和CD133+HepG2细胞各自生长情况。
1.2.5 成瘤实验分别准备1×102、1×103、1×104以及1×105/200 μL 4个浓度组的CD133+、CD133-HepG2细胞,将同种浓度的CD133+、CD133-HepG2细胞分别接种到BALB/c裸鼠两侧下肢皮下,左为CD133-HepG2细胞,右为CD133+HepG2细胞。每组接种3只BALB/c裸鼠。检查每组BALB/c裸鼠移植瘤的生长情况并测量肿瘤长轴,观察5周。以直径>0.5 cm为种植瘤成功。
1.2.6 131I-CD133mAb的制备和鉴定采用氯胺T法,用Na131I标记CD133mAb并纯化。以37 MBq Na131I ∶100 μg CD133的比例标记,在SN-684型放射免疫γ计数仪上测量放射性计量,采用纸层析法计算,放射化学纯度,放射性物质的浓度以及比活度。
1.2.7 细胞侵袭实验溶胶,4 ℃过夜,无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶,去100 μL稀释胶加入Transwell上室中,37 ℃孵育4~5 h,取对数期各组细胞(0、2.4、4.8、9.6 MBq作用24 h),重悬细胞,5×105/mL细胞悬液,上室加200 μL细胞悬液,下室加入600 μL含5 μg/mL fibronectin培养基,37 ℃孵育20~24 h,取出小室,擦去上室未穿过的细胞,倒置,风干,固定,染色,200倍镜下拍照,计数,每组实验重复3次。
1.2.8 Western blot检测试剂盒提取各组细胞蛋 白并定量。每孔50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,将蛋白转印PVDF膜上,用5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h,加入一抗后4 ℃冰箱过夜,一抗稀释比例E-cadherin 1 ∶2 000、N-cadherin 1 ∶2 000、Vimentin 1 ∶2 000,二抗37 ℃ 孵育1 h,ECL化学发光,Bio-Rad凝胶成像系统采集图像,Quantity one软件进行分析,每组实验反复3次。
1.3 统计学分析Transwell、Western blot显影结果经Quantity one软件4.6.2进行图片分析、计算灰度值。数据以x±s表示,采用SPSS 19.0统计软件处理,组间比较应用单因素方差分析。
2 结果 2.1 流式检测CD133的表达率FCM检测结果显示,HepG2中的CD133的表达率为(7.21±0.05)%,CD133+HepG2细胞的表达率为(95.26±0.05)%。CD133+HepG2细胞的表达率明显高于HepG2细胞(P<0.01,图 1)。
2.2 体外成球实验观察CD133+HepG2细胞生长情况CD133+细胞在含生长因子的无血清培养基中成球生长,CD133-细胞在相同条件下细胞形态出现异常,最后细胞逐渐死亡(图 2)。
2.3 体内成瘤实验观察CD133+细胞成瘤能力体内实验结果显示,CD133+细胞可于5周内在BALB/c裸鼠体内右下侧皮下形成皮下移植瘤,而相同条件下CD133-细胞在BALB/c裸鼠体内左下侧皮下成瘤明显小于右侧(图 3)。
2.4 131I-CD133抗体的制备和鉴定氯胺T法标记得131I-CD133抗体,测定其标记率为86.97%,放射化学纯度为98.84%,比活度为0.50 MBq/μg。24、48、72 h测得的放射化学纯度依次为97.28%、96.01%和93.69 %,则131I-CD133抗体在体外具有较好稳定性。
2.5 131I-CD133mAb对CD133+HepG2细胞侵袭能力的影响结果显示(图 4),对照组(0 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞为(130.0±3.6)/视野,而131I-CD133mAb各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞分别为(107.7±3.2)、(76.3±2.5)、(44.0±3.0)/视野,较对照组显著减少(P<0.01),而随着131I-CD133mAb剂量增大而减少,呈现量效关系。
2.6 131I-CD133mAb对CD133+HepG2细胞E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响Western blot检测结果(图 5)显示,与对照组(0 MBq)比较,131I-CD133mAb各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)E钙黏蛋白表达增高(F=173.361,P<0.01),而N钙黏蛋白(F=208.100,P<0.01)、波形蛋白(F=278.390,P<0.01)表达降低,呈现量效关系。
3 讨论现在靶向治疗常用的放射性核素有131I、125I、90Y和188Re等,其中以131I最为常用。131I的半衰期为8 d,在衰变过程发射β射线,通过辐射作用杀死或抑制肿瘤细胞,从而达到治疗目的。经研究证实,131I标记CD133mAb后,其免疫活性可以基本保持不变[14],而CD133又是公认的肝癌干细胞表面标志物,将两者结合,从而实现对肝癌干细胞的靶向内照射。研究发现EMT在肿瘤侵袭和转移过程中起到关键性作用[15],肿瘤细胞变成肿瘤干细胞,EMT是其形成的重要环节。EMT存在最有力的证据是上皮特征丧失和细胞表性改变,如上皮表型标志E-cadherin缺失,而Vimentin、N-cadherin等间充质表型特征分子上调[16]。本实验观察在不同剂量131I-CD133mAb作用于CD133+肝癌干细胞是否可诱导其发生间质-上皮逆转分化(MET)。
本研究采用磁珠分选技术从HepG2肝癌干细胞系中成功分选出CD133+细胞,并且分别用流式检测,体外成球,体内成瘤实验进一步证实通过磁珠分选所得到的CD133+肝细胞是具有干细胞特性的肝癌干细胞。并且用氯胺T法标记得到131I-CD133抗体,测定其具有稳定的标记率(标记率为86.97%),在24、48、72 h测得的放射性化学纯度依次为97.28%、96.01%和93.69%,表明随着时间的增加,131I-CD133抗体放射性化学纯度会降低。为避免过长时间导致脱碘,故选用24 h为本实验的时间节点。为了观察131I-CD133抗体对CD133+肝癌干细胞EMT功能的变化,采用Transwell侵袭实验来证实肿瘤细胞的侵袭性,结果显示131I-CD133抗体可明显抑制CD133+肝癌干细胞的侵袭力,并表现出放射剂量依赖性。为了进一步证实Transwell侵袭实验中CD133+肝癌干细胞随着放射剂量增加,侵袭性降低的分子机制,采用Western blot检测了EMT特异性生物学标记物E钙蛋白、N钙蛋白和波形蛋白的表达水平,发现E钙蛋白的蛋白水平均上调,而N钙和波形蛋白的蛋白水平均下调,而且随着131I-CD133抗体剂量的增加,在体外诱导CD133+肝癌干细胞间质-上皮逆转分化(MET)的作用更明显。
综上所述,本课题组构建的131I-CD133抗体可显著抑制CD133+肝癌干细胞的侵袭力,其机制可能通过调控EMT相关蛋白的表达水平,诱导间质-上皮逆转分化的发生,但通过何种信号通路发生作用,将是本课题组今后研究的主要工作。
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