金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌),是一种重要的人畜共患病原菌,可引起侵袭性化脓感染、食物中毒、心包炎等,危害人和动物健康[1, 2]。流行病学调查证实,在我国重庆地区,医院临床分离的革兰阳性菌中,葡萄球菌居首位[3]。我国耐药监测网 的12家医院2011年向美国JMI实验室提供的2 278株 医院感染细菌中,金葡菌分离率排第1位(占15.1%,343/2 278)[4]。可见金葡菌感染已成为我国重要的公共卫生问题。
金葡菌的致病性与其产生的多种毒力因子有关,如产生毒素休克综合征毒素-1可致毒素休克综合征,产生表皮剥脱毒素导致葡萄球菌烫伤样皮肤综合征,分泌肠毒素引起葡萄球菌食物中毒等;此外,金葡菌还可产生溶血素、杀白细胞素、血浆凝固酶等毒力因子参与致病[5, 6]。毒力因子是细菌致病的“武器”,金葡菌致病性的强弱取决于菌株携带毒力因子的种类和数量。通常认为携带的毒力因子越多,致病性越强,即临床感染中存在一些毒力较强的金葡菌菌株,可引起高致死性疾病[7]。如美国明尼苏达大学医学院Kravitz等报道了一种新出现的致死性疾病,称为葡萄球菌性暴发性紫癜,该病患者表现为在呼吸道感染的康复过程中突然发生病情恶化,患者多死于中毒性休克综合 征,研究称,在此前5年发现的12例该病患者中,仅2例 生存[8]。当然,金葡菌毒力因子的表达受着sigma因子、附属调节因子(accessory gene regulator,agr)等的严格调控,调控因子的突变将直接影响其下游毒力因子的表达,进而引起菌株的毒力变化。监测金葡菌强致病性菌株的出现和流行,探讨其毒力的变异对控制金葡菌感染具有重要意义。
本课题组前期从我校新桥医院分离到1株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA),命名为XQ株,该菌感染一17岁 男性少年,患者10 d内因严重脓毒症而死亡。XQ株经分子生物学鉴定为一株spa t159、agr Ⅳ、PVL+、ST121型金葡菌,动物实验表明其致病性强,但体外传代后菌株毒力明显减弱。本研究采用体外传代、毒力实验、蛋白谱分析、调控基因及毒力因子检测等方法探讨了XQ株毒力变异的机制,揭示重复序列引起的agrC突变是XQ株毒力变异的重要原因。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及实验动物
金葡菌XQ株分离自我校新桥医院急救部,ATCC25923为MSSA对照菌,BALB/c小鼠购自本校实验动物中心,雌性,6~8周龄(20 g左右),SPF级。 1.1.2 培养基及试剂
胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soya broth,TSB)、脑心浸液肉汤培养基(brain heart infusion,BHI)、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxiod公司;溶葡萄球菌素购自Sigma公司;Triton X-100、细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;TriPure试剂购于罗氏公司;痕量DNA降解试剂盒购自Promega公司;逆转录试剂盒购于TaKaRa公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计
根据已报道的金葡菌RN4850(agr型别与XQ株相同)的agr基因序列(GenBank accession no. DQ229853),利用Primer Premier 5.0软件设计PCR及qRT-PCR引物,具体序列见表 1。
引物名称 | 引物序列(5′→3′) | 扩增靶标 | 片段大小(bp) |
agrA-L | GAATACACATTAAAGATTGAAGCA | AgrA | 1 454 |
agrA-R | GCCAGCTATACAGTGCATTTG | ||
agrB-L | TGACCTTTTCCAACATTAGAC | AgrB | 1 495 |
agrB-R | ATTCTTTAGGTATTTCAACTTCG | ||
agrC-L | ATGACAGTTATCGCCATAGGTA | AgrC | 2 514 |
agrC-R | GCCAGCTATACAGTGCATTTG | ||
agrD-L | ATGACAGTTATCGCCATAGGTA | AgrD | 1 409 |
agrD-R | CAAGAATAATACCAATACTGCGA | ||
sigB-L | CTTAATTAAATTAAAAATACCCCTCG | 毒力调节σB因子 | 1 545 |
sigB-R | CCTATGAGACAAGATGGAACTCGTG | ||
hla -L | AAGTGGTTTAGCCTGGCCTTCA | α-溶血素 | 200 |
hla -R | TCGAAACATTTGCACCAATAAGG | ||
hlg -L | TTCGCTTGTATCGCTTGAACCT | δ-溶血素 | 192 |
hlg -R | TCATTCGCCACTGAATCAGGTC | ||
seb-L | TGTATGTATGGTGGTGTAACTGAGC | 葡萄球菌肠毒素B | 207 |
seb-R | AGGCGAGTTGTTAAATTCATAGAGT | ||
sspA-L | CTACAACTACACCGGAAGCAATAAA | 丝氨酸蛋白酶 | 199 |
sspA-R | ACAGACAAACAGCAAACACCTAAGA | ||
RNAⅢ-L | CATGGTTATTAAGTTGGGATGGC | RNAⅢ | 188 |
RNAⅢ-R | GAAGGAGTGATTTCAATGGCACA | ||
LipA-L | ACACAATGTTAGGGTTCAACGACG | 脂酶A | 185 |
LipA-R | AAGAGTAGACTTCGGGTTGGCTC | ||
16S rRNA-L | GCTCGTGTCGTGAGATGTTGG | 16S rRNA | 195 |
16S rRNA-R | TTTCGCTGCCCTTTGTATTGT |
金葡菌XQ株接种于2 mL LB培养基中,37 ℃培养过夜,次日按1 ∶100比例接种于2 mL新鲜无菌的LB培养基中,37 ℃振荡培养过夜,重复上述操作传代200次,分别保存每代细菌。金葡菌ATCC25923接种于2 mL LB培养基中,37 ℃培养过夜备用。 1.2.3 动物毒力实验
将XQ株、传代180次XQ株(XQ180)、ATCC25923分别按1 ∶100比例接种于2 mL TSB中,37 ℃培养至对数生长期(约6 h),用无菌生理盐水稀释至D(600)等于1.0(细菌浓度约为1×108 CFU/mL),按100 μL/只剂量皮下注射感染BALB/c小鼠,常规条件下养殖,观察小鼠皮肤的溃烂程度;同时按上述方法将菌浓度调至1×106 CFU/mL,按100 μL/只剂量尾静脉注射感染小鼠,观察并统计小鼠死亡情况。通过动物毒力实验,将毒力下降的XQ株命名为XQM株。 1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
将过夜菌接种于BHI培养基,37 ℃培养至D(600)为0.8,取1.5 mL菌液10 000×g离心1 min,吸取上清1 mL加入100 μL预冷的饱和TCA溶液,冰浴1 h,制备标本,参见文献[9]方法进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并观察[10]。 1.2.5 目标基因的PCR扩增及核酸测序分析
过夜培养XQ株和XQM株,次日吸取1 mL菌液,10 000×g 离心5 min,采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取XQ株及XQM株的基因组DNA,具体步骤参见细菌基因组提取试剂盒说明书。以提取的细菌基因组DNA为模板,用2×Taq酶及相应的引物分别扩增各毒力调节基因,回收PCR扩增片段,送上海立菲生物技术有限公司进行DNA测序,测序结果用BioEdit软件进行比对分析。 1.2.6 qRT-PCR检测毒力因子表达
取过夜培养菌按1 ∶100比例接种于2 mL无菌BHI中,37 ℃振荡培养至对数生长中期(约6 h),使用TriPure法按试剂盒说明书抽提金葡菌总RNA,利用DNA降解试剂盒进行痕量DNA的去除,再用TaKaRa公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA,用各毒力因子的引物进行荧光定量PCR检测。 1.3 统计学分析
采用SPSS 18.0软件,经独立样本t检验进行统计学分析。 2 结果 2.1 XQ株毒力实验
以1×107 CFU细菌接种小鼠皮下,2周后XQ株感染小鼠的皮肤溃烂程度明显高于对照菌ATCC25923(图 1A);1×105CFU细菌经尾静脉感染小鼠,1周内小鼠的存活率如图 1B所示,对照菌ATCC25923感染小鼠7 d存活率100%,而XQ株感染组小鼠在第2天即全部死亡,7 d存活率为0%,表明XQ株的毒力较强;分别收集XQ株和ATCC25923的菌体和培养上清,经SDS-PAGE电泳后发现两者的菌体蛋白组成没有明显差异,而在上清中,XQ株的蛋白条带与ATCC25923有显著差异(图 1C),表明XQ株的强毒性可能与其分泌的多种毒力因子有关。
为观察XQ的毒力变异,在体外,用LB培养基将XQ株传代培养至200代,用第180代菌株(XQ180)进行小鼠毒力实验,结果发现XQ180的毒力明显下降(图 1D)。 2.2 XQ株连续传代后培养上清的SDS-PAGE电泳分析
为探索传代菌株分泌毒力因子的变化,将每传20代的菌株培养上清进行SDS-PAGE电泳分析,结果见图 2,可见第20代菌株培养上清中的蛋白谱较野生 株有很大差异,而20~200代菌株上清的蛋白谱没有明显改变,表明XQ的毒力变化在20代之前已经发生。
2.3 毒力变异的XQM株对XQ株的1~20代培养上清进行SDS-PAGE分析,发现传至第5代,其上清中的蛋白表达谱即发生改变,毒力下降,将其命名为XQM(图 3A)。在TSB琼脂平板上,XQM株生长较快、菌落较大,呈淡黄色,而野生XQ株菌落较小,呈金黄色(图 3B)。
2.4 重复序列导致XQM株agrC突变通过对XQ株及XQM株sigB(编码sigma因子B)、agrA、agrB、agrC及agrD等毒力调控基因的PCR扩增及核酸测序分析,发现两者的sigB、agrA、agrB及agrD 序列相同,而XQM株的agrC基因第443位被一段188 bp 序列插入,该插入序列为agrC基因第255~442间的序列,且为正向插入,即自身序列重复插入导致AgrC蛋白的截短型突变(图 4),这种突变可能是XQM株毒力下降的重要原因。XQM株在体外用TSB传代20次,对传代后的菌株之agrC基因进行了重新扩增和测序,发现188 bp的插入序列依然存在,表明XQM株具有遗传稳定性。
2.5 agrC突变导致XQM株毒力因子表达降低Agr作为金葡菌毒力的重要调控系统,其组分AgrC的突变可能引起Agr调控靶基因表达水平下降。我们采用qRT-PCR检测了RNAⅢ、α-溶血素、γ-溶血素、肠毒素B、脂酶等毒力基因的表达情况,以16S rRNA基因的检测结果为内参,将XQ株各毒力基因的表达水平进行标准化,即在同一份标本中,用毒力基因表达量/16S rRNA基因表达量,将得到的比值量化为1,再计算XQM中各毒力基因表达量与16S rRNA基因表达量的比值,进行量化后的结果如图 5所示,将两株菌毒力基因的相对表达量进行统计学分析,结果显示XQ株和XQM受agr调控的各毒力基因表达水平差异显著(P<0.01)。表明XQM的致病性降低与其Agr调控的多种毒力因子表达水平显著下降有关。
3 讨论金葡菌是一种重要的社区获得性和医院获得性感染病原菌,可产生50多种毒力因子,引起人类的多种疾病[11, 12]。通常金葡菌携带的毒力基因种类和数量决定着其致病性的强弱,即临床分离的金葡菌菌株可因携带毒力基因不同而致病性不一,存在强毒株与弱毒株之别。然而,某些菌株即使携带多种毒力基因也并不表示其致病性就一定强,因细菌毒力因子的表达还受着多种调控基因的调控,只有毒力因子表达了才能参与致病。细菌的毒力调控系统是复杂的,且往往形成网络式调控。如1984年在金葡菌中发现了全局性的附属调节系统agr[13],该系统由P2和P3两个操纵子组成,控制RNAⅡ和RNAⅢ的转录。RNAⅡ包含AgrA、AgrB、AgrC和AgrD 4个开放的阅读框[14]。AgrC和AgrA可构成一个双组分信号转导系统,当AgrC被信号分子激活后,可激活转录效应分子AgrA,反馈式促进P2和P3操纵子的转录[15]。P3操纵子表达的RNAⅢ是一种RNA调节分子,调节70多个基因的表达,包括30多个已知的毒力基因[16]。另外,sigB基因编码的σB因子通过控制转录因子SarA的表达而参与金葡菌毒力因子的表达调控,SarA可与agr系统 的AgrA相互作用,协同调节RNAⅢ的表达[17]。这些毒力调控分子的缺失或突变势必会影响金葡菌的致病性。
本课题组前期从一17岁男性脓毒症患者(感染10 d死亡)血液中分离出1株金葡菌(XQ株),经鉴定为spa t159、agrⅣ、PVL+、ST121型菌株。ST121型金葡菌是一类强致病性菌株,2007年,德国Schefold等[18]首次报道了ST121型金葡菌(spa分型为t284)导致1例51岁患者肺、肾等多器官功能衰竭的病例。Conceicao等[19]的研究证实ST121型菌株在欧洲国家主要感染儿童,常引起多种器官的侵袭性损害,致病能力强。XQ株感染的患者所在的重庆地区以金葡菌ST239型为主[9],我国目前尚未见对ST121型金葡菌致病性的研究报道。采用小鼠毒力实验,发现1×107CFU的XQ株感染小鼠2周后,动物创口出现深而宽的溃疡,而对照株ATCC25923已趋于恢复;1×105 CFU的XQ株经尾静脉注射感染小鼠2 d全部死亡,显示出XQ株的强致病性。有意义的是,将XQ株在体外传代200次,毒力实验证实第180代菌株较野生株毒力显著下降,推测可能是菌株在传代过程中出现了毒力变异,于是对XQ株及其传代菌株培养上清进行SDS-PAGE电泳,发现传至第5代,菌株培养上清蛋白表达谱即发生了明显改变,菌株生长快,呈淡黄色,毒力也明显下降(XQM株)。
在对细菌致病性研究中,通常是针对某一毒力因子展开,探索某一种毒力因子的缺失或突变对病原菌致病性的影响。本研究发现,XQ株毒力下降后(变为XQM株),其培养上清的多个蛋白因子表达量下降,说明XQM株的毒力下降是由一组毒力因子表达下调引起的,即XQM株调控毒力因子表达的调控基因可能发生了改变。于是,我们对XQM株的sigB、agrA、agrB、agrC和agrD等金葡菌全局性调控分子基因进行了PCR扩增和核酸测序分析,结果发现XQM株agrC基因的第443位核苷酸处出现了一188 bp的插入序列,有趣的是该插入序列正好是agrC基因255~442 bp间的序列,这种自身序列正向重复插入导致AgrC蛋白的截短型突变,影响了AgrC的激活和功能,进而导致Agr的活性下降,毒力基因表达水平普遍下调,最终使得XQM株毒力下降。已有文献报道过,Agr是金黄色葡萄球菌化脓性关节炎诱导和复发的关键决定因素[20],Agr的突变可以减少疾病的发生率和严重程度,Agr的突变也可明显减弱金黄色葡萄球菌的入侵能力[21]。然而,在已报道的Agr突变中,主要是个别位点的点突变;如金葡菌RN4220的agrA基因之3′端多插入一个A,可导致移码突变,引起agr活性的发挥滞后2~3 h[22]。还有研究发现,金葡菌KSI9051的agr操纵子基因469~474位为6个T,当插入1个T后,导致1个截短型AgrC蛋白的产生,影响了菌株的致病性[23]。金葡菌8325-4株的agrA基因其124位发生T/A突变后,不能合成完整的AgrC蛋白,会导致毒力因子表达受影响[24]。本研究发现的XQM株agrC基因被自身重复序列插入而引起的突变尚少见文献报道。在课题研究中,我们也试探性地对XQ株进行重组质粒的转化,试图用基因替换的方法在野生XQ株agrC基因中插入本研究发现的188 bp序列,探讨插入序列对菌株毒力的影响,但未获成功,可能金葡菌临床菌株对DNA转化存在多种限制。
总之,本研究通过动物毒力实验证实XQ株为一ST121型强致病性金葡菌,此类强致病性金葡菌毒株在我国的出现应引起临床上的高度重视。通过细菌培养上清的SDS-PAGE分析,发现XQ株的致病性与多种毒力因子的表达有关,在体外传代后,XQ株易发生毒力变异,变异的XQM株因agrC基因被自身重复序列插入引起的突变而致,agrC基因被插入序列突变后,XQM株的多种毒力因子表达下调,是导致XQM株致病性明显降低的主要原因。至于插入序列致agrC基因突变的具体机制以及agrC突变对XQM株毒力的调控作用还有待进一步深入研究。
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