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重复序列致agrC突变对金黄色葡萄球菌致病性的影响
饶 青1, 尚伟龙1, 周人杰2, 胡启文1, 张晓鹏1, 杨延成1, 胡 珍1, 朱军民1, 饶贤才1    
(400038 重庆,第三军医大学基础医学部微生物学教研室,重庆市微生物工程实验室1400037 重庆,第三军医大学新桥医院急救部2)
摘要:目的 探讨金黄色葡萄球菌XQ株毒力变异的机制。方法 以金黄色葡萄球菌ATCC25923为对照,采用动物实验观察临床分离的金葡菌XQ株在体外传代后的毒力改变;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析菌体及培养上清的蛋白谱变化,应用PCR进行金葡菌附属调节基因agr扩增并测序,分析菌株毒力变异的机制,并进一步通过qRT-PCR检测XQ株agr调控的毒力因子变化情况。结果 动物毒力实验证实XQ株的毒力较对照菌ATCC25923强,体外传代培养后,XQ株第180代菌株(XQ180)的毒力明显下降,SDS-PAGE分析发现毒力下降的XQ株(XQM株)培养上清的蛋白表达谱较XQ株有明显改变,对金葡菌agr基因进行测序分析发现XQM株的agrC基因第443位有一段188 bp的序列插入,而该插入序列就是agrC基因255~442间序列,正是该188 bp重复序列导致AgrC蛋白的截短型突变,引起新桥株的致病性降低,qRT-PCR检测结果证实XQM株中受agr调控的毒力基因表达水平显著下降。结论 临床分离的金葡菌XQ株毒力强,在体外传代中易发生毒力变异,这种变异与重复序列导致的agrC突变有关。
关键词: 金黄色葡萄球菌     致病性     动物毒力实验     附属调节基因agr     重复序列    
Effect of agrC mutant inserted by repeated sequence on pathogenesis of Staphylococcus aureus
Rao Qing1, Shang Weilong1, Zhou Renjie2, Hu Qiwen1, Zhang Xiaopeng1, Yang Yancheng1, Hu Zhen1, Zhu Junmin1, Rao Xiancai1    
(1Department of Microbiology, Chongqing Laboratory of Microbial Engineering, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038; 2Department of Emergency, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China)
Abstract:Objective To investigate the underlying mechanism of variable virulence in Staphylococcus aureus strain XQ. Methods After subculturing in vitro, the virulence change in clinical isolated stain XQ of Staphylococcus aureus (S.aureus) was tested in BALB/c mouse models, and S.aureus strain ATCC25923 was used as control. Protein expression profiles in bacterial cells and supernatants were determined by SDS-PAGE analysis. The genes of accessory gene regulator (agr) were amplified by PCR and then sequenced, and the expression levels of virulence factor genes controlled by agr in XQ and XQM were also determined by quantitative real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR). Results S. aureus XQ strain was more virulent than ATCC25923, however, after culturing in vitro, the virulence of the 180th generation of XQ strain (XQ180) was significantly decreased, and SDS-PAGE analysis demonstrated that the protein expression patterns in the culture supernatants were different between XQ and the virulence attenuated strain (XQM). The sequencing results indicated an extra 188 bp repeated sequence was inserted into the 443th of nucleotide agrC gene, resulting in a truncated mutant of AgrC protein. What’s more, the gene expression levels controlled by agr were markedly reduced in XQM strain. Conclusion XQ is a high-virulence strain of S. aureus, and prone to virulence variation during cultured in vitro. The virulence variation of S. aureus XQ is associated with the agrC mutant caused by a repeated sequence insertion.
metformin: Staphylococcus aureus     pathogenesis     animal toxicity experiments     accessory gene regulatory system     repeated sequence    

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌),是一种重要的人畜共患病原菌,可引起侵袭性化脓感染、食物中毒、心包炎等,危害人和动物健康[1, 2]。流行病学调查证实,在我国重庆地区,医院临床分离的革兰阳性菌中,葡萄球菌居首位[3]。我国耐药监测网 的12家医院2011年向美国JMI实验室提供的2 278株 医院感染细菌中,金葡菌分离率排第1位(占15.1%,343/2 278)[4]。可见金葡菌感染已成为我国重要的公共卫生问题。

金葡菌的致病性与其产生的多种毒力因子有关,如产生毒素休克综合征毒素-1可致毒素休克综合征,产生表皮剥脱毒素导致葡萄球菌烫伤样皮肤综合征,分泌肠毒素引起葡萄球菌食物中毒等;此外,金葡菌还可产生溶血素、杀白细胞素、血浆凝固酶等毒力因子参与致病[5, 6]。毒力因子是细菌致病的“武器”,金葡菌致病性的强弱取决于菌株携带毒力因子的种类和数量。通常认为携带的毒力因子越多,致病性越强,即临床感染中存在一些毒力较强的金葡菌菌株,可引起高致死性疾病[7]。如美国明尼苏达大学医学院Kravitz等报道了一种新出现的致死性疾病,称为葡萄球菌性暴发性紫癜,该病患者表现为在呼吸道感染的康复过程中突然发生病情恶化,患者多死于中毒性休克综合 征,研究称,在此前5年发现的12例该病患者中,仅2例 生存[8]。当然,金葡菌毒力因子的表达受着sigma因子、附属调节因子(accessory gene regulator,agr)等的严格调控,调控因子的突变将直接影响其下游毒力因子的表达,进而引起菌株的毒力变化。监测金葡菌强致病性菌株的出现和流行,探讨其毒力的变异对控制金葡菌感染具有重要意义。

本课题组前期从我校新桥医院分离到1株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA),命名为XQ株,该菌感染一17岁 男性少年,患者10 d内因严重脓毒症而死亡。XQ株经分子生物学鉴定为一株spa t159、agr Ⅳ、PVL+、ST121型金葡菌,动物实验表明其致病性强,但体外传代后菌株毒力明显减弱。本研究采用体外传代、毒力实验、蛋白谱分析、调控基因及毒力因子检测等方法探讨了XQ株毒力变异的机制,揭示重复序列引起的agrC突变是XQ株毒力变异的重要原因。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及实验动物

金葡菌XQ株分离自我校新桥医院急救部,ATCC25923为MSSA对照菌,BALB/c小鼠购自本校实验动物中心,雌性,6~8周龄(20 g左右),SPF级。 1.1.2 培养基及试剂

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soya broth,TSB)、脑心浸液肉汤培养基(brain heart infusion,BHI)、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxiod公司;溶葡萄球菌素购自Sigma公司;Triton X-100、细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;TriPure试剂购于罗氏公司;痕量DNA降解试剂盒购自Promega公司;逆转录试剂盒购于TaKaRa公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计

根据已报道的金葡菌RN4850(agr型别与XQ株相同)的agr基因序列(GenBank accession no. DQ229853),利用Primer Premier 5.0软件设计PCR及qRT-PCR引物,具体序列见表 1

表 1 PCR和qRT-PCR 引物及序列
引物名称 引物序列(5′→3′)扩增靶标片段大小(bp)
agrA-LGAATACACATTAAAGATTGAAGCAAgrA1 454
agrA-RGCCAGCTATACAGTGCATTTG
agrB-LTGACCTTTTCCAACATTAGACAgrB1 495
agrB-RATTCTTTAGGTATTTCAACTTCG
agrC-LATGACAGTTATCGCCATAGGTAAgrC2 514
agrC-RGCCAGCTATACAGTGCATTTG
agrD-LATGACAGTTATCGCCATAGGTAAgrD1 409
agrD-RCAAGAATAATACCAATACTGCGA
sigB-LCTTAATTAAATTAAAAATACCCCTCG 毒力调节σB因子1 545
sigB-RCCTATGAGACAAGATGGAACTCGTG
hla -LAAGTGGTTTAGCCTGGCCTTCAα-溶血素200
hla -RTCGAAACATTTGCACCAATAAGG
hlg -LTTCGCTTGTATCGCTTGAACCTδ-溶血素192
hlg -RTCATTCGCCACTGAATCAGGTC
seb-LTGTATGTATGGTGGTGTAACTGAGC 葡萄球菌肠毒素B207
seb-RAGGCGAGTTGTTAAATTCATAGAGT
sspA-LCTACAACTACACCGGAAGCAATAAA丝氨酸蛋白酶199
sspA-RACAGACAAACAGCAAACACCTAAGA
RNAⅢ-LCATGGTTATTAAGTTGGGATGGCRNAⅢ188
RNAⅢ-RGAAGGAGTGATTTCAATGGCACA
LipA-LACACAATGTTAGGGTTCAACGACG脂酶A185
LipA-RAAGAGTAGACTTCGGGTTGGCTC
16S rRNA-LGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG16S rRNA195
16S rRNA-RTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT
1.2.2 细菌培养与传代

金葡菌XQ株接种于2 mL LB培养基中,37 ℃培养过夜,次日按1 ∶100比例接种于2 mL新鲜无菌的LB培养基中,37 ℃振荡培养过夜,重复上述操作传代200次,分别保存每代细菌。金葡菌ATCC25923接种于2 mL LB培养基中,37 ℃培养过夜备用。 1.2.3 动物毒力实验

将XQ株、传代180次XQ株(XQ180)、ATCC25923分别按1 ∶100比例接种于2 mL TSB中,37 ℃培养至对数生长期(约6 h),用无菌生理盐水稀释至D(600)等于1.0(细菌浓度约为1×108 CFU/mL),按100 μL/只剂量皮下注射感染BALB/c小鼠,常规条件下养殖,观察小鼠皮肤的溃烂程度;同时按上述方法将菌浓度调至1×106 CFU/mL,按100 μL/只剂量尾静脉注射感染小鼠,观察并统计小鼠死亡情况。通过动物毒力实验,将毒力下降的XQ株命名为XQM株。 1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将过夜菌接种于BHI培养基,37 ℃培养至D(600)为0.8,取1.5 mL菌液10 000×g离心1 min,吸取上清1 mL加入100 μL预冷的饱和TCA溶液,冰浴1 h,制备标本,参见文献[9]方法进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并观察[10]1.2.5 目标基因的PCR扩增及核酸测序分析

过夜培养XQ株和XQM株,次日吸取1 mL菌液,10 000×g 离心5 min,采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取XQ株及XQM株的基因组DNA,具体步骤参见细菌基因组提取试剂盒说明书。以提取的细菌基因组DNA为模板,用2×Taq酶及相应的引物分别扩增各毒力调节基因,回收PCR扩增片段,送上海立菲生物技术有限公司进行DNA测序,测序结果用BioEdit软件进行比对分析。 1.2.6 qRT-PCR检测毒力因子表达

取过夜培养菌按1 ∶100比例接种于2 mL无菌BHI中,37 ℃振荡培养至对数生长中期(约6 h),使用TriPure法按试剂盒说明书抽提金葡菌总RNA,利用DNA降解试剂盒进行痕量DNA的去除,再用TaKaRa公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA,用各毒力因子的引物进行荧光定量PCR检测。 1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件,经独立样本t检验进行统计学分析。 2 结果 2.1 XQ株毒力实验

以1×107 CFU细菌接种小鼠皮下,2周后XQ株感染小鼠的皮肤溃烂程度明显高于对照菌ATCC25923(图 1A);1×105CFU细菌经尾静脉感染小鼠,1周内小鼠的存活率如图 1B所示,对照菌ATCC25923感染小鼠7 d存活率100%,而XQ株感染组小鼠在第2天即全部死亡,7 d存活率为0%,表明XQ株的毒力较强;分别收集XQ株和ATCC25923的菌体和培养上清,经SDS-PAGE电泳后发现两者的菌体蛋白组成没有明显差异,而在上清中,XQ株的蛋白条带与ATCC25923有显著差异(图 1C),表明XQ株的强毒性可能与其分泌的多种毒力因子有关。

A、B:分别为相同剂量的XQ株及ATCC25923感染小鼠2周后的伤口情况;C:1×105 CFU金葡菌经尾静脉感染小鼠的存活率; D:XQ株和ATCC25923菌体及培养上清的SDS-PAGE电泳结果,1:XQ菌体,2:ATCC25923菌体,3:XQ培养上清,4:ATCC25923培养上清;E、F:分别为相同剂量的XQ株及XQ180株感染小鼠2周后的伤口情况 图 1 金葡菌XQ株及其体外传代株毒力实验

为观察XQ的毒力变异,在体外,用LB培养基将XQ株传代培养至200代,用第180代菌株(XQ180)进行小鼠毒力实验,结果发现XQ180的毒力明显下降(图 1D)。 2.2 XQ株连续传代后培养上清的SDS-PAGE电泳分析

为探索传代菌株分泌毒力因子的变化,将每传20代的菌株培养上清进行SDS-PAGE电泳分析,结果见图 2,可见第20代菌株培养上清中的蛋白谱较野生 株有很大差异,而20~200代菌株上清的蛋白谱没有明显改变,表明XQ的毒力变化在20代之前已经发生。

图 2 XQ株每隔20代培养上清的SDS-PAGE电泳结果
2.3 毒力变异的XQM

对XQ株的1~20代培养上清进行SDS-PAGE分析,发现传至第5代,其上清中的蛋白表达谱即发生改变,毒力下降,将其命名为XQM(图 3A)。在TSB琼脂平板上,XQM株生长较快、菌落较大,呈淡黄色,而野生XQ株菌落较小,呈金黄色(图 3B)。

A:XQ株与XQM株培养上清蛋白SDS-PAGE电泳结果;B、C:分别为XQ株与XQM株菌落形态 图 3 XQM株与XQ株的培养上清蛋白SDS-PAGE 电泳结果及菌落形态观察
2.4 重复序列导致XQMagrC突变

通过对XQ株及XQM株sigB(编码sigma因子B)、agrA、agrB、agrC及agrD等毒力调控基因的PCR扩增及核酸测序分析,发现两者的sigB、agrA、agrB及agrD 序列相同,而XQM株的agrC基因第443位被一段188 bp 序列插入,该插入序列为agrC基因第255~442间的序列,且为正向插入,即自身序列重复插入导致AgrC蛋白的截短型突变(图 4),这种突变可能是XQM株毒力下降的重要原因。XQM株在体外用TSB传代20次,对传代后的菌株之agrC基因进行了重新扩增和测序,发现188 bp的插入序列依然存在,表明XQM株具有遗传稳定性。

XQM株的agrC基因第443位插入一段188 bp的序列,该插入序列为agrC基因的第255~442之间的序列;RN4850和XQ株的agrC基因全长为1 293 bp,编码430aa,蛋白质理论相对分子质量为49.7×103;XQMagrC基因由于重复序列的插入导致蛋白质翻译提前终止,只编码159aa,产生一个截短型蛋白,蛋白质理论相对分子质量为18.5×103 图 4 金葡菌agrC基因的重复序列插入突变
2.5 agrC突变导致XQM株毒力因子表达降低

Agr作为金葡菌毒力的重要调控系统,其组分AgrC的突变可能引起Agr调控靶基因表达水平下降。我们采用qRT-PCR检测了RNAⅢ、α-溶血素、γ-溶血素、肠毒素B、脂酶等毒力基因的表达情况,以16S rRNA基因的检测结果为内参,将XQ株各毒力基因的表达水平进行标准化,即在同一份标本中,用毒力基因表达量/16S rRNA基因表达量,将得到的比值量化为1,再计算XQM中各毒力基因表达量与16S rRNA基因表达量的比值,进行量化后的结果如图 5所示,将两株菌毒力基因的相对表达量进行统计学分析,结果显示XQ株和XQMagr调控的各毒力基因表达水平差异显著(P<0.01)。表明XQM的致病性降低与其Agr调控的多种毒力因子表达水平显著下降有关。

1:RNAⅢ;2:α-溶血素;3:γ-溶血素;4:葡萄球菌肠毒素B;5:丝氨酸蛋白酶;6:脂酶A 图 5 qRT-PCR检测金葡菌XQ株和XQM株毒力因子 编码基因结果
3 讨论

金葡菌是一种重要的社区获得性和医院获得性感染病原菌,可产生50多种毒力因子,引起人类的多种疾病[11, 12]。通常金葡菌携带的毒力基因种类和数量决定着其致病性的强弱,即临床分离的金葡菌菌株可因携带毒力基因不同而致病性不一,存在强毒株与弱毒株之别。然而,某些菌株即使携带多种毒力基因也并不表示其致病性就一定强,因细菌毒力因子的表达还受着多种调控基因的调控,只有毒力因子表达了才能参与致病。细菌的毒力调控系统是复杂的,且往往形成网络式调控。如1984年在金葡菌中发现了全局性的附属调节系统agr[13],该系统由P2和P3两个操纵子组成,控制RNAⅡ和RNAⅢ的转录。RNAⅡ包含AgrA、AgrB、AgrC和AgrD 4个开放的阅读框[14]。AgrC和AgrA可构成一个双组分信号转导系统,当AgrC被信号分子激活后,可激活转录效应分子AgrA,反馈式促进P2和P3操纵子的转录[15]。P3操纵子表达的RNAⅢ是一种RNA调节分子,调节70多个基因的表达,包括30多个已知的毒力基因[16]。另外,sigB基因编码的σB因子通过控制转录因子SarA的表达而参与金葡菌毒力因子的表达调控,SarA可与agr系统 的AgrA相互作用,协同调节RNAⅢ的表达[17]。这些毒力调控分子的缺失或突变势必会影响金葡菌的致病性。

本课题组前期从一17岁男性脓毒症患者(感染10 d死亡)血液中分离出1株金葡菌(XQ株),经鉴定为spa t159、agrⅣ、PVL+、ST121型菌株。ST121型金葡菌是一类强致病性菌株,2007年,德国Schefold等[18]首次报道了ST121型金葡菌(spa分型为t284)导致1例51岁患者肺、肾等多器官功能衰竭的病例。Conceicao等[19]的研究证实ST121型菌株在欧洲国家主要感染儿童,常引起多种器官的侵袭性损害,致病能力强。XQ株感染的患者所在的重庆地区以金葡菌ST239型为主[9],我国目前尚未见对ST121型金葡菌致病性的研究报道。采用小鼠毒力实验,发现1×107CFU的XQ株感染小鼠2周后,动物创口出现深而宽的溃疡,而对照株ATCC25923已趋于恢复;1×105 CFU的XQ株经尾静脉注射感染小鼠2 d全部死亡,显示出XQ株的强致病性。有意义的是,将XQ株在体外传代200次,毒力实验证实第180代菌株较野生株毒力显著下降,推测可能是菌株在传代过程中出现了毒力变异,于是对XQ株及其传代菌株培养上清进行SDS-PAGE电泳,发现传至第5代,菌株培养上清蛋白表达谱即发生了明显改变,菌株生长快,呈淡黄色,毒力也明显下降(XQM株)。

在对细菌致病性研究中,通常是针对某一毒力因子展开,探索某一种毒力因子的缺失或突变对病原菌致病性的影响。本研究发现,XQ株毒力下降后(变为XQM株),其培养上清的多个蛋白因子表达量下降,说明XQM株的毒力下降是由一组毒力因子表达下调引起的,即XQM株调控毒力因子表达的调控基因可能发生了改变。于是,我们对XQM株的sigB、agrA、agrB、agrC和agrD等金葡菌全局性调控分子基因进行了PCR扩增和核酸测序分析,结果发现XQMagrC基因的第443位核苷酸处出现了一188 bp的插入序列,有趣的是该插入序列正好是agrC基因255~442 bp间的序列,这种自身序列正向重复插入导致AgrC蛋白的截短型突变,影响了AgrC的激活和功能,进而导致Agr的活性下降,毒力基因表达水平普遍下调,最终使得XQM株毒力下降。已有文献报道过,Agr是金黄色葡萄球菌化脓性关节炎诱导和复发的关键决定因素[20],Agr的突变可以减少疾病的发生率和严重程度,Agr的突变也可明显减弱金黄色葡萄球菌的入侵能力[21]。然而,在已报道的Agr突变中,主要是个别位点的点突变;如金葡菌RN4220的agrA基因之3′端多插入一个A,可导致移码突变,引起agr活性的发挥滞后2~3 h[22]。还有研究发现,金葡菌KSI9051的agr操纵子基因469~474位为6个T,当插入1个T后,导致1个截短型AgrC蛋白的产生,影响了菌株的致病性[23]。金葡菌8325-4株的agrA基因其124位发生T/A突变后,不能合成完整的AgrC蛋白,会导致毒力因子表达受影响[24]。本研究发现的XQMagrC基因被自身重复序列插入而引起的突变尚少见文献报道。在课题研究中,我们也试探性地对XQ株进行重组质粒的转化,试图用基因替换的方法在野生XQ株agrC基因中插入本研究发现的188 bp序列,探讨插入序列对菌株毒力的影响,但未获成功,可能金葡菌临床菌株对DNA转化存在多种限制。

总之,本研究通过动物毒力实验证实XQ株为一ST121型强致病性金葡菌,此类强致病性金葡菌毒株在我国的出现应引起临床上的高度重视。通过细菌培养上清的SDS-PAGE分析,发现XQ株的致病性与多种毒力因子的表达有关,在体外传代后,XQ株易发生毒力变异,变异的XQM株因agrC基因被自身重复序列插入引起的突变而致,agrC基因被插入序列突变后,XQM株的多种毒力因子表达下调,是导致XQM株致病性明显降低的主要原因。至于插入序列致agrC基因突变的具体机制以及agrC突变对XQM株毒力的调控作用还有待进一步深入研究。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201409203
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

饶 青,尚伟龙,周人杰,胡启文,张晓鹏,杨延成,胡 珍,朱军民,饶贤才.
Rao Qing, Shang Weilong, Zhou Renjie, Hu Qiwen, Zhang Xiaopeng, Yang Yancheng, Hu Zhen, Zhu Junmin, Rao Xiancai.
重复序列致agrC突变对金黄色葡萄球菌致病性的影响
Effect of agrC mutant inserted by repeated sequence on pathogenesis of Staphylococcus aureus
第三军医大学学报, 2015, 37(05): 398-403.
J Third Mil Med Univ, 2015, 37(05): 398-403.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201409203

文章历史

收稿:2014-09-29
修回:2014-10-15

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