垂体腺瘤属颅内一种常见良性肿瘤，无功能性垂体腺瘤则是垂体腺瘤中最常见的类型，约占垂体腺瘤的30%。无功能垂体腺瘤缺乏明显的激素相关临床症候群，一般只在其侵袭压迫周围组织时，才出现头痛，视力下降、视野缺损等症状。所以其诊断较晚，手术全切率低，复发率极高,加之缺乏特异性药物，患者常常需要再次手术或放射治疗。但常规术后治疗可致垂体功能低下，降低生存质量，增加疾病死亡率。因此，亟需探索无功能性垂体腺瘤侵袭和复发机制，可为无功能性垂体腺瘤临床预后和术前术后及早的合理的干预治疗提供参考。胰岛素样生长因子及其受体在多类肿瘤中可通过多条信号通路促进肿瘤细胞增生及侵袭转移[1],而关于其受体的靶向治疗也已成近期研究热点。因此，本研究以胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)/胰岛素样生长因子1型受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)及其下游信号分子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)为靶点，检测其在侵袭性无功能性垂体腺瘤和复发性无功能性垂体腺瘤中的表达情况，探索其与侵袭性和复发性的关系。
1 资料与方法 1.1 临床资料收集重庆医科大学附属第一医院神经外科2012年 8月至2014年5月60例无功能性垂体腺瘤患者的术后组织标本(经患者知情同意后进行相关实验)，其中 男性30例，女性30例，年龄15～78岁，平均年龄47.5岁。 60例垂体腺瘤根据患者临床症状、内分泌检查和术后病理诊断报告综合判断为无功能性垂体腺瘤。侵袭性垂体腺瘤的判断标准：①本研究采用Wilson改良的Hardy分类法将Ⅲ～Ⅳ级或C、D、E期的肿瘤归为侵袭性腺瘤；②术前影像学改变，CT及MRI可见海绵窦、鞍旁及下丘脑等邻近结构的破坏；③术中所取鞍底 骨质或邻近硬脑膜经病理学证实有肿瘤细胞侵犯；④术 中见鞍底骨质及硬脑膜被侵袭破坏，肿瘤突入蝶窦腔或侵入鞍旁的血管神经。 符合其中之一者即可确定为侵袭性垂体腺瘤。60例标本中，侵袭性腺瘤40例，非侵袭性腺瘤20例。结合既往病史，40例侵袭性腺瘤中16例为复发性腺瘤，24例为非复发性腺瘤。手术时取所需组织用生理盐水洗净积血，一部分置入4％多聚甲醛溶液内固定，一部分直接放入冻存管中，剩余一部分放入经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理过的冻存管中，后两者置入液氮备用。
1.2 实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测IGF-1和IGF-1R的基因表达按RNAiso Plus试剂(购于大连宝生物技术公司)说明书步骤提取总RNA，并逆转录成cDNA ,以GAPDH为内参，进行qReal-Time PCR检测IGF-1和IGF-1R的基因表达水平。PCR引物由生工生物工程公司设计并合成。IGF-1上游引物序列 5′-TTCAACAAGCCCACAGGGTA-3′，下游引物序列 5′-GCAATACATCTCCAGCCTCCT-3′，产物长度 111 bp；IGF-1R 上游引物序列 5′-GTCGAAGAATCGCATCATCA-3′，下游引物序列5′-GCATCCTGCCCATCATACTC-3′，产物长度 277 bp；GAPDH上游引物序列 5′-AGAAGGCTGGGGCTCAT-TTG-3′，下游引物序列 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，产物长度258 bp。反应条件为：95 ℃ 预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火40 s，循环40次。
1.3 免疫组织化学SABC法检测IGF-1 、IGF-1R和VEGF蛋白表达标本经4％甲醛固定，常规石蜡包埋连续切片，HE染色和免疫组化染色。一抗IGF-1 、IGF-1R和VEGF单克隆抗体均购置于美国 Bioworld公司，免疫组化操作参照SABC试剂盒(购置于博士德生物公司)和DAB(购置于北京中杉公司)产品说明书进行。以PBS代替一抗作阴性对照。根据免疫反应积分(immunoreactive score，IRS)半定量法计分：①染色深度，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②阳性细胞比例：在高倍(×400)镜下随机观察5个视野，每个视野计数200个细胞，计算各视野中阳性细胞数的平均百分比，作为该切片的阳性细 胞百分比。5％以下为0分，5％～25％为1分，＞25％～ 50％为2分，＞50％～75％为3分，＞75％以上为4分。两项计分结果相加，0分计为(-)，1～2分计为(+)，3～6分计为(+ +)，6分以上计为(+ + +)，+为可疑阳性，+ +~+ + +均为阳性。
1.4 Western blot检测IGF-1、IGF-1R和VEGF蛋白表达提取无功能性垂体腺瘤标本组织中的蛋白成分；BCA法测定蛋白浓度，加入样品缓冲液，置于沸水浴中加热5 min；制备10％、6％的分离胶和5％浓缩胶； 加样电泳(浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，90 min)； 电泳后湿转至硝酸纤维素膜上(250 mA，30 min；250 mA，100 min)；封闭液室温封闭 4 h；一抗稀释液稀释一抗(IGF-1、IGF-1R和VEGF单克隆抗体购置于美国 Bioworld公司)(1 ∶500～1 ∶1 000)，4 ℃过夜； 二抗稀释液稀释二抗(1 ∶2 000～4 000),室温孵育1～2 h； TBS洗膜3次；显影、定影。采用Image J分析软件比较免疫印迹条带灰度值。
1.5 统计学方法采用PASW 19.0统计软件进行两独立样本t检验、Pearson相关分析、Fisher精确概率法。
2 结果 2.1 qRT-PCR检测IGF-1、IGF-1R基因的表达IGF-1和IGF-1R在侵袭性复发性、侵袭性非复发性、非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤中的mRNA 相对表达量分别为IGF-1(2.16±0.38)、IGF-1R(2.22±0.59)； IGF-1(1.00±0.26)、IGF-1R(1.00±0.30)；IGF-1(0.37±0.16)、IGF-1R(0.42±0.23)，侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤明显高于侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤(P＜0.05)，侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤明显高于非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤(P＜0.05)。
2.2 免疫组织化学SABC法检测IGF-1、IGF-1R和其下游信号分子VEGF蛋白的表达IGF-1和VEGF阳性表达主要为细胞质内棕黄色颗粒，分布于淡蓝色细胞核周围。IGF-1R阳性表达可见胞膜和胞质内棕黄色颗粒。IGF-1、IGF-1R和VEGF在侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤组织中阳性表达率分别为87.5%(14/16)、93.8%(15/16)和100.0%(16/16)；在侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中阳性表达率分别为50.0%(12/24)、58.33%(14/24)和62.5%(15/24)；在非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中阳性表达率分别为15.0%(3/20)、20.0%(4/20)和20.0%(4/20),侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤组织与侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织比较差异具有统计学意义(P＜0.05),侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织与非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织比较差异具有统计学意义(P<0.05，图 1)。
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| A、D、G：分别为非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织IGF-1、IGF-1R和VEGF阳性表达；B、E、H：分别为侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织IGF-1、GF-1R和VEGF阳性表达；C、F、I：分别为侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤组织IGF-1、IGF-1R和VEGF阳性表达 图 1 免疫组化检测IGF-1、GF-1R和VEGF在无功能性垂体腺瘤组织的表达(SABC ×400) |
IGF-1、IGF-1R和VEGF在侵袭性复发性无功能 性垂体腺瘤组织中免疫印迹条带灰度值分别是(0.64± 0.26)、(1.25±0.30)、(1.28±0.29)；在侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中分别是(0.56±0.13)、(0.96±0.22)、(0.98±0.18)；在非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中分别是(0.22±0.08)、(0.65±0.16)、(0.60±0.19)。侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤组织与侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织与非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织比较差异具有统计学意义(P＜0.05，图 2)。
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| 1：侵袭性复发性无功能性垂体腺瘤；2：非侵袭性非复发无功能性垂体腺瘤；3：侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤 图 2 Western blot检测IGF-1、IGF-1R和VEGF蛋白在无功能性垂体腺瘤中的表达 |
在侵袭性复发性、侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达量呈正相关(r=0.85，r=0.80，P＜0.05)，IGF-1R和VEGF蛋白表达量呈正相关(r=0.74，r=0.70，P＜0.05)；在非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤组织中IGF-1和IGF-1R蛋白表达量呈正相关(r=0.73，P＜0.05)，IGF-1R和VEGF蛋白表达量无明显相关性(P>0.05)。
3 讨论IGF系统于1957年由Salmon和Daughaday等首次发现，属一类广谱促生长因子，在胚胎发育、细胞增殖与分化和机体代谢等方面都发挥着重要作用。IGFs的异常能促进肿瘤血管增生、侵袭转移和抗凋亡，影响肿瘤发生、发展进程。大量前期实验已证明IGF-1/IGF-1R促进胃癌、直肠癌、胰腺癌及非小细胞肺癌等肿瘤细胞的侵袭转移，且能通过抑制IGF-1/IGF-1R缓解肿瘤的恶性进展[2, 3, 4, 5]。IGF-1/IGF-1R通过多条细胞信号通路促进肿瘤侵袭转移。Dunn等[6]已证明IGF-1/IGF-1R能通过AP-1、PI3K和MAPK信号通路上调尿激酶型纤溶酶原活化因子(u-PA)的表达水平，而u-PA通过促进细胞外基质(ECM)水解参与多种肿瘤的侵袭转移。其中垂体腺瘤的侵袭性就与u-PA和PI3K表达上调明显相关[7]。IGF系统也能调控金属蛋白酶(MMPs)的表达，从而参与肿瘤的侵袭转移进程。在垂体腺瘤中，MMP在肿瘤的侵袭过程中同样也起到了重要作用[8]。另外，VEGF在包括垂体腺瘤在内的多类肿瘤的侵袭复发中起到重要作用，而IGF-1R亦能通过调节VEGF、肿瘤细胞内钙黏蛋白及纤黏蛋白的表达水平促进肿瘤生长转移。因此，我们推导IGF-1/IGF-1R通过下游分子的信号传导在垂体腺瘤的侵袭性生长中也发挥了重要作用。本研究选取了其下游信号分子VEGF，分析了VEGF与肿瘤侵袭复发的相关性及与IGF-1/IGF-1R表达的相关性。而本研究结果也证明：IGF-1和IGF-1R在侵袭性、非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤中，无论是mRNA相对表达量还是蛋白表达量都存在显著差异，且实验结果具有统计学差异，即IGF-1/IGF-1R与无功能性垂体腺瘤的侵袭性行为存在明显相关性。VEGF在侵袭性非复发性、非侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤中蛋白表达量也存在显著差异，且在侵袭性非复发性无功能性垂体腺瘤中与IGF-1R蛋白表达量呈正相关(r=0.70，P＜0.05)。即，过表达的IGF-1/IGF-1R可能通过VEGF信号通路促进无功能性垂体腺瘤的侵袭生长。IGF-1是一类广谱促生长因子，与多种生长因子之间存在网络关系，相互影响表达水平。Simes等[9]曾报道了生长激素(GH)能促进IGF-1合成和分泌；另外的研究亦证明IGF-1/IGF-1R能调节GH和PRL合成与分泌[10, 11]。而垂体能分泌多种激素，垂体腺瘤各亚型也异常分泌激素，这些已知的未知的激素间的相互作用势必会影响IGF的表达水平，从而影响实验结果的分析。而本实验长期大量收集激素分泌无异常的无功能性垂体腺瘤标本，排除了激素间的相互影响，一定程度上控制了其他变量，分析侵袭性这一单因变量，就更能准确地反映IGF-1/IGF-1R与肿瘤侵袭性的关系。
IGF-1/IGF-1R亦具有促进肿瘤细胞增生和抗凋亡作用，IGF-1/IGF-1R引导的抗凋亡研究也已成当前热点。大量实验证明IGF-1/IGF-1R过表达与胃癌、胰腺导管腺癌、膀胱癌和非小细胞肺癌的肿瘤大小和复发及预后密切相关[12, 13, 14, 15]。而本研究证明了IGF-1/IGF-1R及VEGF与无功能性垂体腺瘤的复发密切相关，即过表达的IGF-1/IGF-1R可能通过VEGF信号通路促进无功能性垂体腺瘤复发。IGF-1/IGF-1R在多种肿瘤的发生及恶性进展中起着重要作用，近期研究证明能通过抑制IGF-1R表达降低肿瘤细胞增殖活性、侵袭力和复发性，从而缓解肿瘤恶性进展改善预后[16, 17, 18]。本研究证明了IGF-1/IGF-1R与无功能垂体腺瘤的侵袭性和复发性密切相关，以此为基础，我们将探索IGF-1/IGF-1R与生长激素腺瘤早期高侵袭性的关系，还将继续从分子水平深入研究IGF-1/IGF-1R在垂体腺瘤侵袭性、复发性行为恶性进展中的具体作用机制，以期为临床无功能性垂体腺瘤预后和术前术后及早的合理的干预治疗提供参考。
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