哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)蛋白家族的成员之一，属于丝/苏氨酸蛋白激酶^[1]。mTOR复合体能够通过磷酸化其下游的靶蛋白如40S 核糖体S6 蛋白激酶(p70 ribosomal protein S6 kinases，p70S6K)和真核启动因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1)等来调节细胞的生长、增殖和凋亡等活动。近年来研究表明，mTOR信号通路的异常活化与多种癌症发生发展密切相关^[2]。在粒细胞白血病细胞中，mTOR通路处于异常活化状态^[3]。

三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)是从植物三七中提取的有效药用成分^[4]。研究显示PNS及其单体具有抗肿瘤作用^[5]，然而，有关PNS对白血病细胞的作用研究较少，且其作用的机制尚不明确。本研究通过观察PNS抑制K562细胞增殖过程中mTOR信号通路部分信号分子的变化来探讨PNS抑制K562细胞增殖的机制。

K562细胞株为本实验室冻存，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，MTT、DMSO购自Sigma公司，蛋白裂解液和蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，三七总皂苷购自南京广润生物制品有限公司，一抗mTOR、p70S6K、4E-BP1、p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6K(Thr229/389)、p-4E-BP1(Thr37/46)购自Affinity Biosciences 公司，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗鼠IgG，购自Santa Cruz公司。

三七总皂苷用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基溶解并稀释成5 mg/mL,分装后4 ℃保存。

使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养。待细胞浓度达到10⁶/mL时进行半量换液，半量换液3次后离心去除培养基进行传代。选择对数生长期的细胞进行各项实验。

取对数生长期的K562细胞，离心后弃去旧培养基，加入新鲜培养基，调整细胞浓度为10⁵/mL,每孔50 μL 接种于3个96孔板，再加入三七总皂苷稀释液，最后补齐培养基100 μL，使三七总皂苷的终浓度分别为0、50、100、200、400、800 μg/mL，每种浓度设置5个复孔，同时设置空白孔。3个96孔板分别孵育24、48、72 h，结束孵育前4 h向各孔加入20 μL MTT溶 液(5 mg/mL)，继续培养4 h后2 000 r/min离 心15 min，吸去上清，最后每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，充分溶解后使用酶标仪检测各孔光密度值[D(490)],计算5个复孔的平均值。细胞存活率= [D(490)_给药-D(490)_空白]/[D(490)_对照-D(490)_空白]。 实验重复3次。

取对数生长期的K562细胞离心去旧培养基，加入新鲜培养基重悬，接种于6孔板中，加入三七总皂苷稀释液，最后补齐培养基3 mL，使细胞浓度为2×10⁵/mL，三七总皂苷终浓度分别为0、100、200、400 μg/mL。培养24 h后收集全部细胞于离心管中，1 000 r/min 离心10 min,使用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为10⁶/mL，取细胞悬液100 μL，加入AO、EB 工作液(100 μg/mL)各2 μL，混匀后取1滴涂于载破片上，在荧光显微镜下计数200个细胞并计算红色荧光细胞的比例。分类标准：A活细胞：核染色质呈均匀绿色荧光并结构正常；B早期凋亡细胞：核染色质呈绿色固缩状或串珠状；C晚期凋亡细胞和死亡细胞：核染色质为桔红色并呈固缩或圆珠状或核染色质着均匀桔红色。实验重复3次。

K562细胞分组及加药情况同1.5，72 h后收集细胞，提取总RNA,紫外分光光度计测量RNA浓度，每组取2 μg RNA进行逆转录，合成cDNA第1条链后，按照剂盒要求对各组样本目的基因mTOR、p70S6K、4E-BP1及内参基因GAPDH 进行扩增。引物序列、扩增长度及退火温度见表 1。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s，退火35 s,72 ℃延伸35 s，共30个循环；继而72 ℃10 min终止延伸，4 ℃保存。反应完成后取5 μL PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳。使用Bio-Rad凝胶成像仪检测条带并进行灰度分析。计算各组mTOR、p70S6K和4E-BP1mRNA的相对表达量。

实验分组、药物浓度及培养时间同1.6，收集各组细胞后用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后各取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。其中mTOR使用6%分离胶，p70S6K及β-actin使用10%分离胶，4E-BP1使用12%分离胶。然后转膜至PVDF膜，室温封闭2 h。4 ℃孵育一抗过夜。TBST洗膜后37 ℃孵育二抗2 h。TBST洗膜，ECL显色后在Bio-Rad凝胶成像仪上曝光检测条带并进行灰度分析。

取对数生长期的K562细胞接种于6孔板中，加入三七总皂苷稀释液，最后补齐培养基3 mL，使细胞浓度为2×10⁵/mL，对照组不加药培养3 h后收集细胞提取总蛋白,实验组三七总皂苷终浓度为200 μg/mL，分别于培养1、2、3 h后收集全部细胞提取总蛋白，使用p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6K(Thr229/389)、p-4E-BP1(Thr37/46)蛋白抗体检测磷酸化蛋白，方法同上。

使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以x±s 表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

采用1.4中的公式处理MTT实验中的光密度结果，计算得出细胞存活率(表 2)。结果显示PNS浓度为50 μg/mL时，作用时间达到72 h，药物才表现出抑制细胞增殖的作用(P＜0.05)。PNS浓度为100～800 μg/mL，作用时间为24～72 h时，其对细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性，即随着时间的延长及药物浓度的增加，PNS对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。通过统计分析得出PNS对K562细胞72 h的IC₅₀为(229.07±2.36)μg/mL。

经AO/EB染色后放大200倍镜检(图 1)显示，三七总皂苷作用于K562细胞24 h后，红色荧光细胞数目较对照组增多，且红色荧光的细胞数目所占的比例随着药物浓度的增加而增加。在浓度为100、200、400 μg/mL 时，红色荧光细胞比例分别为(12.2±2.0)%、(24.8±1.9)%、(44.2±2.1)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果显示，三七总皂苷能够促进K562细胞的死亡及凋亡，且具有浓度依赖性。

A：对照组；B：50 μg/mL组；C：100 μg/mL组；D：200 μg/mL组；E：400 μg/mL组 图 1 AO/EB 双荧光染色法检测三七总皂苷作用24h后K562细胞的凋亡及死亡变化 （×200）

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RT-PCR 结果显示：经100、200、400 μg/mL PNS 作用72 h后,mTOR mRNA 的表达量均有降低。 上述3种药物浓度下，mTOR mRNA的相对表达量较对照组均显著降低(P＜0.05，图 2)。而p70S6K及4E-BP1的mRNA没有明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。

A：RT-PCR检测mTOR mRNA表达；B：mTOR mRNA相对表达；C：RT-PCR检测p70S6K mRNA表达；D：RT-PCR检测4E-BP1 mRNA表达 M：标准，1：对照组，2：100 μg/mL组，3：200 μg/mL组，4：400 μg/mL组；a：P＜0.05,与对照组(0 μg/mL)比较 图 2 PNS作用于K562细胞72 h后mTOR、p70S6K及4E-BP1 mRNA的变化

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mTOR信号通路中各蛋白大部分以无活性状态存在，当上游信号刺激后发生磷酸化，转变为活化状态。癌细胞中的mTOR信号通路异常活化。Western blot结果显示三七总皂苷作用于K562细胞72 h后，100 μg/mL 组、200 μg/mL组、400 μg/mL组 mTOR总蛋白的相对表达量较对照组显著降低(P＜0.05，图 3)。而p70S6K及4E-BP1这两种总蛋白的变化无 统计学意义(P＞0.05)。图 4显示对照组及200 μg/mL 三七总皂苷作用于K562细胞1、2、3 h后，mTOR、p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平逐渐减低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。

A：Western blot检测结果 1：对照组，2：100 μg/mL组，3：200 μg/mL 组，4：400 μg/mL组；B：半定量分析 a：P＜0.05,与对照组(0 μg/mL)比较 图 3 PNS作用于K562细胞72 h后mTOR、p70S6K和4E-BP1的蛋白表达变化

图选项

A：Western blot检测结果 1：对照组，2：PNS作用1 h组，3：PNS 作用2 h组，4：PNS作用3 h组；B：半定量分析 a：P＜0.05,与对照组(0 h)比较 图 4 三七总皂苷作用于K562细胞不同时间后mTOR、p70S6K及4E-BP1蛋白磷酸化水平变化

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三七是常用的传统中药，三七皂苷被认为是三七的主要生理活性成分。近年来研究发现PNS能够明显抑制肝癌、前列腺癌、宫颈癌等癌细胞增殖。研究结果显示，浓度为200 μg/mL PNS作用72 h对宫颈癌HeLa细胞的抑制率为(54.57±0.976)%^[6]；PNS对前列腺癌PC-3细胞的48 h IC₅₀值为931.3 μg/mL^[7]；200 μg/mL 的PNS作用72 h对HepG2、BEL-7402和 SMMC-7721三株肝癌细胞的增殖抑制率分别为(33.18± 0.13)%、(29.40±0.04)%、(33.38±0.18)%，而PNS对正常肝细胞L-02的增殖抑制不明显^[8]。本实验MTT结果显示，当浓度为100～800 μg/mL，PNS对K562细胞增殖有明显的抑制作用且具有时间依赖性 和浓度依赖性，其72 h的IC₅₀为(229.07±2.36)μg/mL。 由上述研究结果可知PNS对多种癌细胞具有增殖抑制作用，且不同癌细胞对PNS的敏感度不同。

由于PNS并非单一化学物质，因此其作用的靶点可能有多个。目前研究发现30 μmol/L PNS中的单体三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和Rg1作用SW480细胞48 h后能够显著增加其凋亡，且能将细胞阻滞在S期及G₂/M期^[9]； PNS能够抑制乳腺4T1细胞迁徙和侵袭^[10]； PNS能够降低PC-3细胞MMP-2及VCAM-1的 表达，抑制PC-3细胞迁移^[7]。通过观察本实验AO/EB 双荧光染色结果可发现，PNS能够促进K562细胞死亡及凋亡，浓度为100、200、400 μg/mL的PNS作用于K562细胞24 h后，死亡及凋亡的细胞总比例分别为(12.2±2.0)%、(24.8±1.9)%、(44.2±2.1)%。表明PNS主要是通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和迁移来发挥抗肿瘤作用。

K562细胞株是慢性粒细胞白血病急性变细胞株。Bcr/Abl是慢粒细胞的特征性融合蛋白，具有强烈的酪氨酸激酶活性^[11]，可促进Ras/MAPK、Jun/STAT5、PI3K/Akt/mTOR等多种信号途径的激活,其中PI3K/Akt/mTOR途径是Bcr/Abl介导的细胞恶性转化的关键环节^{[12, 13]}。有学者研究发现，Bcr/Abl阳性细胞株中mTOR途径激活，其下游底物p70S6K及4E-BP1以Bcr/Abl依赖性方式被磷酸化^[14]。mTOR信号通路可整合多种细胞外信号，参与基因转录、核糖体合成、蛋白质翻译等生物过程，在肿瘤细胞的生长和凋亡中发挥重要作用。那么PNS对K562细胞的抑制作用是否是与mTOR通路有关？本实验使用100～400 μg/mL PNS作用K562细胞72 h后发现，PNS能够通过降低K562细胞mTOR的转录水平来抑制mTOR蛋白的表达，并且能够降低K562细胞mTOR、p70S6K及4E-BP1蛋白的磷酸化水平。因为mTOR信号通路与细胞的生长、增殖及凋亡情况密切相关，且实验结果显示，mTOR信号通路的活性在PNS抑制K562细胞增殖的过程中受到了抑制，所以，降低mTOR信号通路的活性可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一。

目前白血病的临床治疗多采用大剂量的联合化疗法，此疗法副作用大，尤其对机体免疫系统有很大伤害。研究人员发现PNS联合化疗药物比单独化疗药物具有更强的抗肿瘤作用。崔玲玲等^[15]发现PNS能明显增加K562细胞对Ara-C的敏感性；王远航等^[16]使用PNS联合低剂量的环磷酰胺作用于黑色素瘤模型小鼠，发现此种方法有增强抗肿瘤效果，并且能够提高小鼠免疫力。总之，PNS不仅具有抗肿瘤的作用，而且能够降低化疗药物的毒副作用，这提示PNS可以作为临床化疗药物的辅助用药。本实验研究发现降低mTOR信号通路的活性可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一，为PNS治疗白血病的临床应用提供了一定的理论基础。