胃癌是一种在世界范围内非常常见的疾病,位于癌症死亡常见病因的第2位[1]。由于早期无明显症状及体征,往往难于早期诊断,到发现时多为晚期,治疗亦棘手。研究表明胃癌的GMⅡ[2]、FEN1[3]等基因的表达异常促进了胃癌的发生、发展。因此,探讨胃癌发生、发展的相关的基因以及进行针对性靶向治疗将是长期以来的研究重点。
高尔基体基质蛋白(Golgi matrix protein,GM130)定位于高尔基体的顺面囊上,对于高尔基体扁平囊重生和扁平囊堆叠起着至关重要的作用。它参与糖基化的控制、细胞周期进程以及在分泌途径中蛋白和脂质的转运。近来研究显示,已有将其作为有效抗癌治疗的靶向[4]。研究表明GM130在维持高尔基体结构形态中是首要的候补分子[5]。因此,GM130很快成为一种潜在流行的高尔基体标记物,发现其广泛表达于宫颈癌[6]、前列腺癌[7]、肺腺癌[8]等多种肿瘤,并与其发生、发展密切相关。目前国内外关于GM130在胃癌中的作用和意义报道极少,尚需深入研究。本实验通过在胃癌细胞株下调GM130的表达,观测其生物学行为的变化,为进一步研究GM130在胃癌发生、发展中的作用提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料胃癌细胞株MKN-28、MKN-45和SGC-7901均为重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心冻存。RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司。胎牛血清、Opti-MEM购自Gibco公司。qRT-PCR试剂盒、DNA marker购自TaKaRa公司。Total RNA提取试剂盒购自OMEGA公司。Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司。GM130-siRNA-519、GM130-siRNA-683、GM130-siRNA-1163和Negative control siRNA由上海吉玛基因公司合成。GM130、β-actin的引物由宝生物工程大连有限公司合成。兔抗人GM130多克隆抗体购自Abcam公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。Matrigel胶购自Bio-Rad 公司,Transwell 小室购自Millipore 公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养和转染胃癌细胞株MKN-28、 MKN-45和SGC-7901 细胞均接种在含10%新生牛血清、 1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的RPMI1640培养液中,37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞长到90%时进行传代培养,将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化,加含10%新生牛血清的RPMI1640培养液终止消化。2~3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。由公司针对GM130设计并合成3条有效片段转染到高表达的胃癌细胞株中,筛选出一条有干扰效果的GM130-siRNA-519,其正义链:5′-CUGGACUCCAGCUAUGUAATT-3′,反义链:5′- UUA-CAUAGCUGGAGUCCAGTT-3′;阴性对照组(negative control siRNA)正义链:5′-UUCUCCGAACGUGUCA-CGUTT-3′;反义链:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-TT-3′。转染前1 d,消化对数生长期的MKN-45和SGC-7901细胞,按照1.0×105/mL分别接种于6孔板内,2 mL/孔,待细胞融合度达到40%,按照Lipofectamine 2000说明书进行操作,实验分组:(1)GM130 siRNA组:转染GM130特异性siRNA的RNA干扰组;(2)negative control siRNA组:转染非特异性siRNA的阴性对照组。
1.2.2 Western blot检测3种细胞株的GM130蛋白的表达分别收集MKN-28、MKN-45和SGC-7901细胞,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。样品和上样缓冲液以4 ∶1混合变性,取38 μg/孔蛋白样品上样,经10% SDS-PAGE后,将蛋白样品转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入GM130抗体(1 ∶1 000)和β-actin抗体(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,每次10 min,HRP标记Ⅱ抗(1 ∶2 000)孵育2 h,ECL化学发光显影。
转染48 h后,收集MKN-45各组细胞(GM130-siRNA-519、GM130-siRNA-683、GM130-siRNA-1163、Negative control siRNA),取35 μg/孔蛋白样品上样,余步骤同上。
1.2.3 RT-PCR检测3种细胞株的GM130 mRNA的表达及沉默GM130后在MKN-45中mRNA的表达提取3种细胞株及转染24 h后的MKN-45各组细胞(GM130-siRNA-519、GM130-siRNA-683、GM130-siRNA-1163、 Negative control siRNA)的总RNA,核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度,按照TaKaRa逆转录反应说明书合成cDNA。将逆转录的cDNA 为模板,进行PCR反应,以β-actin为内参,各引物序列如下。PCR反应条件如下:第1步95 ℃ 预变性 2 min;第2步 94 ℃ 30 s、退火58.5 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min ,共35个循环;最后72 ℃ 10 min。结束后取反应产物5 μL 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.4 qRT-PCR检测沉默GM130后在胃癌细胞MKN-45的mRNA表达水平提取转染24 h后的MKN-45各组细胞(GM130-siRNA-519、GM130-siRNA-683、GM130-siRNA-1163、Negative control siRNA)总RNA,将逆转录反应后的cDNA产物稀释10倍后,以β-actin为内参进行实时荧光定量PCR,反应条件为95 ℃ 预变性10 s;95 ℃ 5 s,58.5 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s(39个循环),反应结束后建立溶解曲线。GM130上游引物:5′-GCTGGTCTTACGGCTTGTGG-3′;下游引物:5′-CATTCTCGTCAGCCCGGTAA-3′;β-actin上游引物:5′-CCTTCTACAATGAGCTGCGT-3′;下游引物:5′-CCT-GGATAGCAACGTACATG-3′。
1.2.5 MTT法测定MKN-45细胞的生长增殖曲线转染24 h,分别收集MKN-45的实验组、对照组的细胞,配成2.0×104/mL细胞悬液接种于96孔板内,100 μL/孔,每组设5个复孔。然后将培养板于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 d,每24 h取出96孔板,各孔加入20 μL(5 mg/mL,即0.5%MTT),4 h后弃掉上清液,加DMSO 150 μL/孔,置于摇床10 min,酶标仪检测波长490 nm处光密度值[D(490)]。
1.2.6 Matrigel 检测细胞侵袭能力将Matrigel 胶和枪头置于4 ℃冰箱过夜,用预冷的无血清RPMI1640培养基按8 ∶1 稀释Matrigel 胶并混匀,每孔80 μL均匀铺在24孔Transwell 上室的聚碳酸酯膜上,紧贴小室底部加入并防止气泡的产生,置于37 ℃孵箱3 h。收集转染24 h后的各组细胞,用0.25%胰蛋白酶消化液对细胞进行消化,并制备成单细胞悬液,计数后将5×103 /孔接种于上室,将小室放于24孔板中,上室中加入250 μL无血清RPMI1640培养基,下室中加入750 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,37 ℃,5%饱和湿度培养箱中培养24 h取出小室,用棉签轻轻擦掉上室细胞,PBS洗3次,800 μL甲醇固定30 min,0.1%结晶紫染色20 min,蒸馏水冲洗干净,室温风干。显微镜下随机取5个视野计数,求取平均数。
1.2.7 Transwell检测细胞迁移能力从37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养12 h取出Transwell 小室,余步骤同侵袭实验。
1.2.8 Western blot检测GM130表达下调后侵袭相关分子的表达变化收集转染48 h后的各组细胞,采用Western blot检测GM130(抗体稀释比例为1 ∶1 000)、MMP-2(1 ∶400)、MMP-9(1 ∶1 000)等的表达,β-actin抗体(1 ∶1 000),具体步骤同1.2.2。
1.3 统计学分析上述每个实验重复3次,采用SPSS 17.0统计学软件,计量资料用x±s表示,2组均数比较采用双样本t检验,多组均数间的比较用单因素方差分析。
2 结果 2.1 GM130高表达胃癌细胞株的筛选Western blot和RT-PCR结果见图 1。GM130在中、低分化程度的胃癌细胞株中呈高表达状态(P<0.05),由于低分化胃癌MKN-45细胞具有更强的转移能力,故选择MKN-45细胞株用于后续实验的研究。
2.2 下调GM130表达在胃癌细胞中干扰效率的检测Western blot、RT-PCR及qRT-PCR结果显示,GM130特异性siRNA 3条序列片段分别转染MKN-45细胞后,GM130-siRNA-519片段在MKN-45细胞株中被有效抑制,与对照组相比水平明显下降(P<0.05,图 2)。表明GM130-siRNA-519有效片段在低分化MKN-45细胞中被有效沉默。
2.3 下调GM130对低分化胃癌细胞MKN-45增殖的影响MMT法检测结果显示,与阴性对照组相比,转染组的细胞增殖受到明显抑制(P<0.05,图 3)。
2.4 下调GM130对低分化胃癌细胞MKN-45侵袭能力的影响转染48 h后,显微镜下计数对照组和转染组穿越过基底膜的细胞数,结果显示,GM130转染组与阴性对照组中,每个低倍视野细胞数分别为(89.8±6.3)和(15.2±6.1)。转染组穿过基底膜的细胞数目显著低于对照组(P<0.05,图 4)。说明下调GM130基因后,MKN-45细胞的侵袭能力明显下降。
Western blot检测结果显示,下调GM130后,MKN- 45细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦下调(图 5)。说明下调GM130基因后,MKN-45细胞的侵袭能力下降。
2.5 下调GM130对低分化胃癌细胞MKN-45迁移能力的影响转染48 h后,显微镜下计数对照组和转染组穿过Transwell上室的细胞数,结果显示,GM130转染组与对照组中,每个低倍视野细胞数分别为(147.8±13.1)和(54.6±10.6)。转染组穿过小室的细胞数目明显低于对照组(P<0.05,图 6)。说明下调GM130基因后,MKN-45细胞的迁移能力明显下降。
3 讨论高尔基体是分泌途径中的一个主要的细胞器,负责接收从内质网运输来的几乎所有的新合成的分泌蛋白和膜蛋白,并将其处理、分类及运输到相应靶组织。近来研究表明内质网、高尔基体和溶酶体被视为干预癌症治疗的潜在靶向[9, 10]。GM130作为一种顺面高尔基体基质蛋白,参与高尔基体结构的维持,在有丝分裂期间高尔基体的裂解和重组中起着重要作用[11, 12, 13, 14]。当GM130蛋白锚定在高尔基体上时,能够稳定高尔基体的形态,并且有利于细胞分裂后扁平囊的重组装,才能将内质网运输过来的蛋白通过高尔基体进行翻译,加工修饰和分选,然后通过分泌运输到特定的亚细胞部位而发挥功能[14, 15]。另外,还参与控制糖基化[16]、细胞周期进程[17]、细胞极化 [18]和定向细胞移动[19]。GM130与多种类型的肿瘤侵袭和转移行为密切相关。下调GM130可使肺癌细胞侵袭能力下降,抑制小鼠肺癌模型中肿瘤生长及肿瘤血管生成[4];下调GM130抑制了高尔基体堆积中横状池的融合并干扰了影响分泌和膜蛋白的高尔基体酶的一致分布[20];亦导致内质网到高尔基体的运输部分程度地抑制或耽搁[21],而内质网和高尔基体能够刺激细胞共存机制和细胞自杀程序[22, 23]。因此,控制内质网和高尔基体间的运输可能为抗癌治疗开辟独径。已有研究通过沉默GM130作为抗癌治疗的靶向来改变内质网和高尔基体之间蛋白运输的平衡[4]。
我们在前期实验中,初步分析了GM130在胃癌发生、发展中可能扮演着重要的角色[24]。本研究通过Western blot和RT-PCR检测在不同分化程度胃癌细胞(MKN-28、SGC-7901、MKN-45)GM130蛋白的表达和mRNA的水平,结果都显示,在中分化胃癌细胞系SGC-7901和低分化胃癌细胞系MKN-45中的蛋白呈高表达水平。进而在低分化胃癌细胞系MKN-45中,从蛋白和mRNA水平上筛选出针对GM130基因有明显干扰效果的siRNA,研究其沉默后对其生物学行为变化的影响。MTT法结果显示:与阴性对照组相比,转染组的细胞增殖受到明显抑制作用,表明下调GM130,抑制了胃癌肿瘤细胞的增殖。
侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征,不仅与肿瘤细胞的侵袭性增强、粘附能力下降有关,还与肿瘤的血管生成、细胞外基质的降解及间质重构等密切相关,本研究在体外侵袭实验中通过Transwell小室内铺一层Matrigel基质胶,来模拟人体基膜中的Ⅳ型胶原和层黏连蛋白等成分,细胞为获得营养物质向小室下方移动,一般正常细胞穿透基膜的能力较低,肿瘤细胞则会改变自身形态和分泌多种蛋白酶来降解胞外基质来促进其移动。Western blot检测结果显示,GM130表达下调后MMP-2、MMP-9表达也下调。表明下调GM130后,癌细胞中的高尔基复合体功能减退,分泌基质金属蛋白酶能力减弱,证明了其侵袭能力下降;与对照组相比,抑制转染组细胞增殖;其迁移和侵袭能力明显下降。
总之,本研究表明GM130与胃癌的恶性发展过程有密切关系,为临床治疗胃癌提供了新的靶向。但是GM130在胃癌发生、发展中的作用机制,以及在侵袭迁移中的分子机制和信号通路尚需进一步研究。
志谢 感谢在实验过程中给予细心帮助和耐心指导的李海玉同学以及实验室平台的所有成员
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