2 730000 兰州,甘肃省骨关节疾病重点实验室
2 Key Laboratory of Bone and Joint Diseases, Lanzhou, Gansu Province, 730000, China
骨肉瘤是一种发病率较高的肿瘤,约占骨科恶性肿瘤总数的一半[1],恶性程度高,多发于青少年。其发生的主要机制是成骨细胞增殖过度[2]。尽管治疗模式不断发展,但因肿瘤细胞易侵袭和迁移,仍有20% ~40%的患者最终死于骨肉瘤[3]。研究表明Wnt信号通路与骨肉瘤的形成、转移和凋亡过程关系密切[4]。β-catenin是Wnt信号通路中的一种转录激活因子,在多种人体恶性肿瘤如骨肉瘤、乳腺癌和淋巴瘤中均有异常表达,且与肿瘤转移密切相关。β-catenin在细胞中以两种形式存在:一种为结合型,与上皮钙粘附素(E-cadherin)结合于细胞质膜的内表面,在细胞内形成E-cadherin/catenin复合体,介导同种细胞间的粘附;另一种为游离型,参与Wnt信号传导途径,通过核膜进入到细胞核内,与DNA亲和蛋白LEF/TC结合,激活靶基因,其靶基因C-myc、cyclinD1、MMP-7、CD44、Claudin-1等在肿瘤发生、发展过程中扮演了重要的角色[5]。因此,Wnt/β-catenin信号通路的激活是引起肿瘤发生、发展的机制之一[6]。研究表明,β-catenin 可以调节间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞的分化,在维持骨和软骨的动态平衡中发挥重要作用 [7, 8, 9]。因此,Wnt/β-catenin信号通路的激活会促进成骨细胞的过度增殖,同时抑制破骨细胞的作用从而导致骨肉瘤的发生。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是转录生长因子β(TGFβ)超家族的一员。研究表明BMP2-8在骨肉瘤临床标本中有不同程度的异常表达[10]。但是,BMP9在骨肉瘤发生、发展过程中的作用尚不清楚。本研究拟通过携带BMP9的重组腺病毒转染骨肉瘤细胞MG63,上调BMP9的表达,分析BMP9过表达对肉瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响,以及对Wnt/β-catenin信号通路相关分子的影响,以期对骨肉瘤的诊断和治疗提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂
DMEM培养液(美国HyClone公司),胎牛血清(美国HyClone公司),0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司),MTT(美国Sigma公司),细胞凋亡与坏死检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),Transwell小室(美国Corning公司),TRIzol(美国Invitrogen公司),反转录试剂盒(美国Thermo公司),SYBR Premix Ex TaqⅡ(大连宝生物工程有限公司),RIPA裂解液(美国Sigma公司),BMP9兔多抗、c-myc小鼠多抗(美国Santa Cruz公司),β-catenin兔多抗(江苏碧云天生物技术研究所),cyclinD1兔多抗、E-cadherin兔多抗、山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。 1.1.2 腺病毒和细胞株
腺病毒载体AdBMP9和AdGFP(绿色荧光蛋白)均由上海吉满生物科技有限公司构建;人骨肉瘤细胞株MG63购自中国科学院上海细胞库,细胞培养在DMEM培养液中,加入10%胎牛血清,于37 ℃和5% CO2体积分数的温浴箱中培养,每3天换1次液,待细胞长满培养皿底,用0.25%胰蛋白酶消化,平均分配后完成传代。 1.2 方法 1.2.1 腺病毒干预细胞有效性鉴定
实验分3组:BLK(空白对照)组、AdGFP+MG63(转染空病毒)组、AdBMP9 +MG63(转染BMP9)组。将骨肉瘤细胞以1×105/孔接种于6孔板,待细胞融合度达到40%时,加入AdGFP或AdBMP9重组腺病毒进行感染。转染培养48 h后,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,随后收获细胞提取RNA和蛋白进行目的基因BMP9的表达分析。 1.2.2 MTT法检测细胞增殖
吸弃培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞,轻轻吹打后制成单细胞悬液,接种于96孔板中,放置于37 ℃,5% CO2的孵箱中 继续培养,在24、48、72 h 3个时间点分别取出1个96孔 板,加入180 μL完全培养基和20 μL事先准备好的MTT溶液,继续培养4 h。1 000 r/min离心后吸弃上 清,加入200 μL DMSO,振荡10 min,酶标仪测定490 nm 处各孔光密值[D(490)]。每组实验重复3次,计算各组光密值的平均值。 1.2.3 Hoechst染色检测细胞凋亡
吸弃培养液后消化,轻轻吹打制成单细胞悬液,在96孔板中每孔接种1.0×104个细胞,加入200 μL培养液,在37 ℃,5% CO2的孵箱中继续培养,实验分组同1.2.1。分别于24、48、72 h 3个时间点各取出1个96孔板,吸弃培养基,PBS洗涤后加入等量的Hoechst染液,4 ℃条件下孵育30 min,洗涤后荧光显微镜下观察计数。每组实验重复3次,计算平均值。 1.2.4 Transwell实验检测细胞的迁移能力
吸弃培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞,轻轻吹打后制成单细胞悬液,以每孔5.0×104的细胞量接种于48孔板,实验分组同1.2.1。用不完全培养液(不含胎牛血清)培养细胞24 h后,再次消化细胞并计数,在每个Transwell小室的上腔中接种1.0×105个细胞,下腔中加入完全培养液。培养48 h后将小室用95%酒精固定,进行HE染色。在倒置显微镜下计数转移至微孔膜下层的细胞,每组实验重复3次,计算平均值进行统计分析。 1.2.5 实时定量PCR
细胞转染腺病毒24、48、72 h后,收获细胞,随后按TRIzol试剂说明书收集细胞总RNA,氯仿抽提RNA,按Thermo反转录试剂盒说明书合成cDNA,实时定量PCR反应体系共20 μL(SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL,无菌去离子水 7 μL,上下游引物各1 μL,cDNA模板1 μL),反应条件(94 ℃预变性10 min;94 ℃变性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃后延伸10 min)。引物序列:BMP9上游引物5′-TTCCTTCAGAGCAAACAGCA-3′,下游引物5′-GTTGTGCTCAAATCCCCATT-3′,片段大小1 597 bp;β-catenin上游引物5′-AAGTTCTTGGCTATTACGACA-3′,下游引物5′-ACAGCACCTTCAGCACT-CT-3′,片段大小1 151 bp;c-myc上游引物5′-ATGACCTCGACTACGACTC-3′,下游引物5′-TTCACCATGTCTCCTCCCAGC-3′,片段大小281 bp;cyclinD1上游引物5′-ATGGAACACCAGCTCCTGTG-3′,下游引 物5′-TGTCGGTGTAGATGCACAG-3′,片段大小369 bp; E-cadherin 上游引物5′-ATCAAAGGTATCACGGCAAAGG-3′,下游引物5′-CGGAGAGCTCGTCCACGTAT-3′,片段大小211 bp;内参β-actin上游引物5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′,下游引物5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′,片段大小 268 bp。熔解曲线的条件为65~95 ℃,目的基因和β-actin基因表达量根据2-ΔΔCt法获得。 1.2.6 Western blot检测
细胞转染腺病毒培养48 h 后,吸弃培养液,加入RIPA裂解液收集细胞总蛋白,并测定蛋白浓度。每个样本取50 μg蛋白,经SDS-PAGE分离蛋白(80 V跑浓缩胶至样品被压成1条线后,
增加电压至120~200 V跑完),电转仪转膜60 min; 采用2.5%的脱脂奶粉封闭1 h,分别加入1∶500稀释后的BMP9和c-myc,1 ∶200稀释后的β-catenin,cyclinD1 和E-cadherin,4 ℃孵育过夜;洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的1∶1 000稀释的二抗孵育2 h,采用ECL方法显影。
1.3 统计学分析
采用SPSS 16.0统计软件,数值用x±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析。 2 结果 2.1 重组腺病毒转染进入MG63细胞
BLK组无明显GFP表达,AdGFP组和AdBMP9组均有明显的报告基因GFP表达,说明MG63细胞中转入了重组腺病毒(图 1)。
2.2 AdBMP9重组腺病毒转染有效提高细胞中BMP9的表达实时定量PCR结果显示,转染AdBMP9(7.56±0.69)后,MG63中BMP9的表达是AdGFP组(1.17±0.29)的6.5倍,是BLK组(1.05±0.25)的7.2倍(P<0.05)。Western blot检测显示,转染AdBMP9后,MG63中BMP9的表达灰度值为(1.58±0.08),表达水平分别较AdGFP组增加65%(P<0.05,图 2)。提示重组腺病毒AdBMP9能够携带相应基因进入MG63细胞,并提高BMP9的表达水平。
2.3 BMP9的过表达能够提高骨肉瘤细胞MG63的增殖能力MTT实验结果显示:AdGFP组与BLK组相比无显著性差异(P>0.05);而AdBMP9组与AdGFP组相比,D(490)值在48 h和72 h时均显著增高,分别较AdGFP组增加33%(P<0.05)和34%(P<0.05)。说明BMP9能够促进MG63细胞增殖。 2.4 BMP9的过表达能够促进骨肉瘤细胞MG63的凋亡
Hoechst染色显示,AdBMP9组细胞凋亡率在24、48、72 h时分别较AdGFP组增加68%、65%(P<0.05)和63%(P<0.05)。说明过表达BMP9会促进MG63的凋亡。 2.5 BMP9的过表达能够提高骨肉瘤细胞MG63的迁移能力
Transwell实验发现,48 h后,AdGFP组(41.60±3.65)与BLK组穿膜细胞数(44.00±3.18)比较,差异无统计学意义(P>0.05),AdBMP9组穿膜细胞数(75.60±2.20)较AdGFP组增加45%(P<0.05)。表明BMP9能够提高MG63细胞的迁移能力。 2.6 BMP9过表达能提高β-catenin、c-myc和cyclinD1的表达
细胞转染AdBMP9 24、48、72 h后提取细胞总RNA,应用实时定量PCR方法从mRNA水平分别检测β-catenin以及Wnt/β-catenin通路下游基因c-myc、cyclinD1的表达。β-catenin、c-myc和cyclinD1基因在转染后24 h时即明显表达,转染后48 h时表达增强,且呈现时间依赖性增强,至72 h分别是AdGFP组的5.6、5.9倍和3.2倍(P<0.05)。图 3显示,Western blot从蛋白水平检测转染AdBMP9后MG63中β-catenin、 c-myc和cyclinD1表达灰度值分别是(2.98±0.21)、(3.12±0.22)和(5.34±0.54)(48 h),表达水平较AdGFP组增加77%(P<0.05)、59%和86%(P<0.05)。BMP9的过表达提高了Wnt/β-catenin信号通路中相关分子β-catenin、c-myc和cyclinD1的表达水平,表明Wnt/β-catenin信号通路被活化。
2.7 BMP9过表达能降低E-cadherin的表达细胞转染AdBMP9 24、48、72 h后检测E-cadherin的表达(图 3),E-cadherin表达呈现时间依赖性减弱,在24、48、72 h的表达分别是AdGFP组的7/10、1/2(P<0.05)和1/5(P<0.05)。蛋白水平的检测显示表达水平较AdGFP组下降89%(P<0.05)。表明,BMP9过表达降低了细胞间粘附分子E-cadherin的表达,造成骨肉瘤细胞更易于迁移。 3 讨论
本实验通过重组腺病毒技术研究BMP9过表达对骨肉瘤细胞MG63的作用发现:一方面,BMP9的过表达的确促进了骨肉瘤细胞MG63的增殖,显著增加了细胞的数量;另一方面,BMP9的过表达也促进了MG63的凋亡,具有减少细胞数量的趋势。这看似矛盾。本研究证明,BMP9的过表达提高了β-catenin的表达,促进了Wnt/β-catenin信号通路的下游分子的表达,MG63细胞很可能通过这个途径提高了增殖能力;另外,MG63细胞有可能通过其他途径同时促进了凋亡。研究证明,β-catenin的过表达有可能会促进骨肉瘤细胞的凋亡[11],具体的机制需要进一步研究。实际上,上述一正(促进增殖)一负(促进凋亡)两种作用在细胞内既相互协调,又相互制约,体现了生物体内动态平衡的机制。这也可能是BMP9分子自身的一种平衡调节机制,在骨肉瘤细胞水平呈现的总效应是促进性的。
Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤发生、发展过程中的主要途径之一。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的中心分子,其表达的上调会导致该肿瘤发生途径的异常活化。文献[12]报道,β-catenin表达的增加也会促进骨肉瘤的发生,推测是由于Wnt/β-catenin信号通路的激活导致下游靶基因的表达,促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移[13]。本研究发现BMP9的高表达促进了Wnt/β-catenin信号通路的激活,提高了该信号通路核心分子β-catenin的表达,进而促进癌基因c-myc和cyclinD1的表达升高。同时,BMP过表达降低细胞间粘附分子E-cadherin的表达,从而减弱细胞之间作用力,表明BMP9高表达可能造成骨肉瘤细胞易于脱离原发灶而促进骨肉瘤的转移。
Wnt/β-catenin对于骨肉瘤的发生起了重要的作用,目前对于该通路的研究方向主要集中于该通路的调节位点,主要是各个蛋白激酶之间的相互作用对信号传导的影响,如降解复合体(GSK-3、APC、Axin、CK)的各个酶功能,协调作用及其对整体的调控,下游转录因子的调控,与其他信号通路的交联作用等。蛋白磷酸酶1就是一种新发现的可以参与Wnt/β-catenin信号通路的调节位点[14],通过它可以将更多的信号通路作用或者蛋白分子引入信号的传导过程,继而可以寻求出更多新的相互交联作用。从这些相互交联作用了解上述多种信号通路的作用过程,具体的调节位点及功能对于我们了解骨肉瘤的机制有着极为重要的作用。正是基于这样的思路,本研究想探讨BMP9对于骨肉瘤细胞MG63的作用是否与Wnt/β-catenin信号通路有直接关系。实验证明,BMP9对于骨肉瘤细胞的促进作用很可能是通过活化Wnt/β-catenin信号通路而实现的。当然骨肉瘤的发病过程中肯定不止Wnt/β-catenin一个信号通路或者某一个蛋白分子在发生作用,但是本研究有助于我们发现更多的参与其中的相关蛋白基因,选取调节作用位点,改变目前骨肉瘤治疗过程中对化疗药物耐药的病例对药物的敏感性,同时为选取新的治疗位点探索新的思路。
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