喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)占全身恶性肿瘤5.7%~7.6%,是常见的头颈肿瘤之一,每年全世界约有2.4%的新发病例[1]。90%的喉癌属于鳞状细胞癌,其中约67%的喉癌为声门型。近几十年,喉癌的5年生存率未得到改善,且有下降趋势[2]。术后复发是治疗失败的主要原因之一,因此寻找一个有效的预测指标准确评估喉癌患者术后的复发风险至关重要。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和肝细胞生长因子受体(mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met)是原癌基因的表达产物,二者的过表达均可在头颈肿瘤中被发现[3]。EGFR的过表达可通过激活下游信号通路导致细胞增殖,凋亡抑制和诱导分化等[4]。EGFR过表达与头颈肿瘤患者的不良预后及无疾病生存时间密切相关[3]。c-Met是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的受体,当c-Met被HGF激活后可促进细胞迁移、侵袭和血管生成[5, 6]。前期研究发现,c-Met与EGFR可在头颈肿瘤细胞株中呈共表达状态[4],且c-Met的激活与EGFR抑制剂的耐药密切相关[7]。既往研究已经证实c-Met和EGFR的过表达均与头颈肿瘤复发密切相关[3, 8, 9],但二者与声门型喉鳞癌术后复发的关系暂不明确。因此,本研究采用免疫组化方法分析c-Met和EGFR蛋白在声门型喉鳞癌中的表达情况及与喉癌术后复发的相关性。 1 资料与方法 1.1 一般资料
回顾性分析我院2006年12月至2013年12月经病理诊断证实为声门型鳞状细胞癌患者共66例。若经随访2年以上未出现局部区域复发或远处转移者入组未复发组,在术后2年内经病理证实发生局部区域复发或远处转移者被入组复发组,每组各33例。患者均为男性,中位年龄为60 (39~79) 岁。临床分期依据AJCC/TNM分期系统(2002年),其中Ⅰ期9例,Ⅱ期30例,Ⅲ期17例,Ⅳ期10例。病理分化等级依据WHO肿瘤组织学分型标准,高分化22例,中分化41例,低分化3例(表 1)。排除标准:术前进行放疗或化疗;术前被诊断为远处转移;手术切缘阳性;未进行正规治疗。 1.2 免疫组化方法及评分原则
66例声门型喉鳞癌组织的石蜡标本被连续切片,厚3 μm,用人类c-Met多克隆抗体和EGFR单克隆抗体(均购自中杉金桥生物技术有限公司)进行免疫组化检测。免疫组化(immunohistochemistry,IHC)方法采用即用型快捷免疫组化Max VisionTM检测试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司)。实验步骤按说明书进行。用已知阳性切片做阳性对照,以PBS代替一抗做阴性对照。所有病理切片由2名经验丰富的病理科医师在没有临床病理资料的情况下进行评分。若结果存在差异则被再次评估,直到达成共识。免疫组化着色强度被分为4级:0(无着色);1(淡黄色);2(黄色);3(棕黄色),然后在5个高倍视野下评估被特异性着色的细胞百分比(0%~100%)。c-Met的阳性表达被定义为超过30%的细胞被着色为黄色或棕黄色[10],EGFR的阳性表达被定义为超过10%的细胞被特异性着色[11]。H评分值为着色强度与细胞阳性率乘积(范围0~300)[11]。 1.3 统计学分析
应用SPSS 16.0软件统计分析。组间免疫组化H评分采用Kruskal-Wallis检验。单因素及逐步Logistic回归分析临床病理因素、c-Met蛋白表达和EGFR蛋白表达与声门型喉鳞癌术后复发的相关性。ROC曲线分析联合检测EGFR和c-Met蛋白表达对复发的预测效能。均为双侧检验。 2 结果 2.1 c-met和EGFR在声门型喉鳞癌组织中的表达
结果显示,c-Met及EGFR的阳性表达部位主要是细胞膜,部分有细胞质着色(图 1),二者的IHC阳性表达率分别为68.2%和90.9%。c-Met在复发组的H评分中位值显著高于未复发组(中位值: 240 vs 210,χ2=12.79,P=0.001)。同样,复发组中EGFR的中位值也显著高于未复发组(中位值: 180 vs 120,χ2=10.436,P<0.001)。
2.2 c-Met和EGFR表达与声门型喉鳞癌术后复发的关系66例患者的c-Met 和EGFR的H评分中位值分别为150 (0~270)和225 (0~270)。c-Met或EGFR的H评分值若高于中位值被定义为高表达,相反为低表达。单变量Logistic回归分析表明,c-Met高表达或EGFR高表达患者的复发风险均显著增加(OR=7.111,P<0.001; OR=5.290,P=0.002)。临床病理因素(如:年龄、T分期、N分期、临床分期、分化程度、吸烟及饮酒等)与复发无显著相关性(表 1)。以全部基线病理特征、c-Met蛋白表达及EGFR蛋白表达作为候选变量,逐步回归建立的初步主效应模型表明,c-Met高表达和EGFR高表达均是声门型喉磷癌术后复发的独立危险因素(OR=5.909,P=0.002; OR=4.231,P=0.013,表 2)。
临床特征 | 未复发组(n=33) | 复发组(n=33) | OR(95%CI) | P |
年龄(岁) | ||||
≤60 | 19(54.3) | 16(45.7) | 1 | |
>60 | 14(45.2) | 17(54.8) | 1.034 (0.976~1.094) | 0.255 |
吸烟史 | ||||
是 | 29(52.7) | 26(47.3) | 1 | |
否 | 4(36.4) | 7(63.6) | 1.952 (0.512~7.437) | 0.327 |
饮酒史 | ||||
是 | 23(50.0) | 23(50.0) | 1 | |
否 | 10(50.0) | 10(50.0) | 1.000 (0.350~2.857) | 1.000 |
T分期 | ||||
T1~T2 | 21(47.7) | 23(52.3) | 1 | |
T3~T4 | 12(54.5) | 10(45.5) | 0.761 (0.273~2.124) | 0.602 |
N分期 | ||||
N0 | 32(52.5) | 29(47.5) | 1 | |
N1~N2 | 1(20.0) | 4(80.0) | 4.414 (0.466~41.801) | 0.196 |
临床分期 | ||||
Ⅰ~Ⅱ | 19(48.7) | 20(51.3) | 1 | |
Ⅲ~Ⅳ | 14(51.9) | 13(48.1) | 0.882 (0.330~2.355) | 0.802 |
分化程度 | ||||
低分化 | 2(66.7) | 1(33.3) | 1 | |
中分化 | 22(53.7) | 19(46.3) | 1.727 (0.145~20.578) | 0.665 |
高分化 | 9(40.9) | 13(59.1) | 2.889 (0.226~36.868) | 0.414 |
EGFR | ||||
低表达(<225) | 23(69.7) | 10(30.3) | 1 | |
高表达(≥225) | 10(30.3) | 23(69.7) | 5.290 (1.851~15.116) | 0.002 |
c-Met | ||||
低表达(<150) | 24(72.7) | 9(27.3) | 1 | |
高表达(≥150) | 9(27.3) | 24(72.7) | 7.111 (2.407~21.011) | <0.001 |
变量 | 回归系数β | 标准误 | Wald统计量 | P | OR | 95%CI |
EGFR 高表达与低表达 | 1.442 | 0.582 | 6.132 | 0.013 | 4.231 | 1.351~13.250 |
c-Met 高表达与低表达 | 1.776 | 0.582 | 9.302 | 0.002 | 5.909 | 1.887~18.506 |
另外,将EGFR和c-Met同时低于中位值定义为低风险组,两个指标均高于中位值为高风险组。高风险组的复发风险是低风险组的25.0倍(OR=25.000,95%CI: 4.93~126.7)。用初步主效应模型计算得到 的复发预测概率值绘制ROC曲线,曲线下面积为0.795,提示联合检测EGFR 和c-Met的表达情况对评 估声门型喉磷癌术后复发具有中等预测效能(图 2)。
3 讨论头颈肿瘤具有解剖学多样化及分子生物学机制各不同的特点,这些异质性均可降低预测因子的特异性[12]。喉癌与其他头颈肿瘤的主要区别为男女比例较高及5年生存率在近30年未得到改善[2]。喉癌的5年生存率为73%左右,其中近1/5的患者会在术后2年内发生复发,且复发患者的5年生存率将低于50%[13]。本研究显示,c-Met和EGFR蛋白表达高低对声门型喉鳞癌术后复发具有预测价值。
EGFR是一个相对分子质量为170×103的跨膜蛋白,位于染色体7p12。EGFR与配体结合形成二聚体使细胞内酪氨酸激酶领域被激活,导致细胞增殖、凋亡抑制和血管生成等作用[4]。超过90%的头颈鳞癌会出现EGFR的过表达[3]。目前,EGFR的靶向药物(如:西妥昔单抗)已被美国FDA批准用于头颈肿瘤治疗[14]。随机临床试验证实西妥昔单抗联合放疗可改善头颈肿瘤的局部控制率,降低患者的死亡率[15]。Wei等[16]的研究显示,EGFR在喉鳞癌中的过表达率为87.5%。已有大量研究报道,EGFR的表达水平可作为喉癌局部复发、无疾病生存期及总生存期的独立预测因子[17, 18]。本研究结果再次证实EGFR高表达的声门型喉鳞癌患者术后复发风险显著增加。
HGF是一个由间充质细胞旁分泌作用于上皮细胞、相对分子质量为100×103 的肝素结合型多肽。c-Met 作为HGF受体,主要表达于上皮细胞,包括内分泌细胞、肝细胞、纤维细胞、角质细胞和黑色素细胞等,具有促进细胞迁移、侵袭和血管生成等作用[19]。在大多数实体肿瘤中均可发现c-Met的阳性表达[20]。前期研究发现,c-Met可作为肺癌、肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及头颈鳞癌等肿瘤的预后指标[21]。Kim等[10]的研究发现c-Met表达与口腔癌的淋巴结转移、病理分级和疾病复发密切相关,且c-Met为阳性表达的患者有更高的复发风险。但在声门型喉鳞癌中,关于c-Met蛋白表达与术后复发关系的研究鲜见报道。本研究显示,c-Met表达高低对声门型喉鳞癌术后复发同样具有预测价值,且预测作用优于EGFR。
体外试验发现,c-Met与EGFR可共表达于头颈肿瘤细胞株中[4]。c-Met和EGFR的激活可相互协同,且c-Met可在HGF缺失的情况下被EGFR激活[22]。当c-Met和EGFR被活化后均可使PI3K/AKT和RAS/MAPK等下游信号通路被激活,导致肿瘤的进展[4]。国内外的既往研究认为,c-Met和EGFR是喉癌发生、发展中的重要因子[17, 10, 23, 24],但二者联合检测对声门型喉鳞癌术后复发的预测作用的相关研究鲜见报道。本研究显示,联合检测c-Met和EGFR在声门型喉磷癌组织中的表达情况对评估术后复发具有良好的的预测价值,且优于单一指标的作用。
综上所述,本研究证实c-Met和EGFR的表达高低对声门型喉鳞癌患者的术后复发均具有预测作用,且c-Met的预测价值优于EGFR。因此,检测c-Met和EGFR在声门型喉磷癌组织中的表达情况,可有效评估术后复发风险,并为患者尽早选择恰当的个体化治疗方案提供依据。
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