心肌梗死(myocardial infraction，MI)是严重危害人类健康的心血管疾病。根据中国心血管病报告2013[1]，我国心血管病患病率处于持续上升阶段，其主要原因是由于缺血性心脏病死亡率上升。目前全国心血管病患者有2.9亿，其中心肌梗死250万。近几年来，细颗粒物(PM2.5)作为心血管疾病发生、发展的重要危险因素[2, 3, 4, 5, 6, 7]引起了广泛的关注。最新的全球疾病 负担报告[2]：估计全世界微粒空气污染每年造成310万 人死亡，22%的伤残调整生命年(DALY)是由于缺血性心脏病引起。
细颗粒物(PM2.5)是指大气中空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，可经呼吸道进入体内。其毒性作用与其粒径小、成分复杂[8, 9, 10]密不可分，PM2.5进入体内作为化学激惹物发挥其毒性作用。在冠脉闭塞的情况下，心肌细胞因缺血缺氧死亡是心肌梗死的一个重要的原因，而细胞膜完整性的破坏是心肌细胞凋亡坏死的一个重要病理原因。在近几年的研究中发现Mitsugumin 53(MG53，亦称TRIM72)特异性表达于心肌和骨骼肌中，对细胞膜的直接修复作用在心肌和骨骼肌细胞中得到证实[11, 12, 13, 14]。当细胞膜受损，内源性MG53就会向受损细胞膜附近聚集发挥修复保护作用。基于此，本研究通过建立大鼠心肌梗死模型[15]，气道滴灌法模拟吸入PM2.5，明确PM2.5对大鼠心肌梗死的影响，并检测心肌组织中MG53蛋白的表达变化，为PM2.5加重心肌梗死可能与抑制MG53蛋白的表达有关提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物及分组
SPF级雄性SD大鼠40只，体质量210~250 g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，普食饲养。实验分为4组：假手术(Sham)组，心肌梗死(MI)组，Sham+PM2.5组，MI+PM2.5组(n=10)。 1.1.2 仪器与试剂
TH-150AⅡ型智能中流量空气总悬浮微粒采样器(武汉市天虹仪表有限责任公司)，超声振荡清洗仪(东莞市洁康超声波设备有限公司)，麻醉挥发罐(Omeda 公司，美国)，HX-300S 动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司)，Vivid E9 心脏超声仪器(GE公司，挪威)，玻璃纤维滤膜(武汉市天虹仪表有限责任公司)，异氟烷(山东科源制药有限公司)，戊巴比妥钠和TTC(Sigma公司，美国)，MG53单克隆抗体(合作单位提供)，GAPDH抗体(Santa Cruz 公司，美国)。 1.2 方法 1.2.1 PM2.5的采集及溶液配制
采样时段：2014年 2-7月期间，采样地点：大坪医院。通过使用TH-150AⅡ型智能中流量空气总悬浮微粒采样器采集PM2.5于玻璃纤维滤膜上,除阴雨天气关闭采样器外，其余时间进行24 h连续中流量采样收集。将附有PM2.5的纤维滤膜剪成1 cm×2 cm的滤条，浸于三蒸水内，室温下超声振荡，60 min/次，共5次，用6层纱布过滤PM2.5振荡液于玻璃皿内，－20 ℃冷冻真空干燥。使用前称量PM2.5干粉，用无菌PBS缓冲液配制成10 mg/mL的混悬液，再次超声灭菌混匀，4 ℃保存待用。 1.2.2 大鼠心肌梗死模型的建立
SD大鼠用2.5%的戊巴比妥钠以60 mg/kg进行腹腔麻醉，将其仰面置于37 ℃恒温加热手术台上，设置好呼吸机参数(潮气量35～40 mL，呼吸比为2 ∶1，呼吸频率75～85/min)，在大鼠呼吸平稳状态下开胸暴露胸腔，撕开心包膜，MI组于左心耳下缘约2 mm处用6-0带线缝合针结扎左冠状动脉前降支，心肌表面变白，心电图示ST段抬高，表明手术成功。Sham组只穿过左冠状动脉前降支而不进行结扎，余步骤同MI组。术毕再将Sham组分成Sham组和Sham+PM2.5组，将MI组分成MI组和MI+PM2.5组，共4组。Sham组与MI组将用PBS缓冲液滴灌气道，Sham+PM2.5组与MI+PM2.5组用PM2.5混悬液进行气道滴灌处理。 1.2.3 气道滴灌法建立染毒PM2.5模型
连接好麻醉挥发罐及氧气系统，异氟烷持续吸入麻醉大鼠，仰面固定其上齿及四肢于操作板上，向外轻拉鼠舌，用橡筋外拉下齿保持张口状态，竖立操作板使大鼠处于直立位，在舌根部滴灌PM2.5混悬液(10 mg/mL)，40 μL/次，3次/周，共4周。对照组同法滴灌等量PBS缓冲液。 1.2.4 心脏超声检测心功能
气道滴灌4周后异氟烷持续麻醉大鼠，使用心脏超声检测左室舒张末期内径(left ventricular internal dimension diastole，LVIDd)，左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)，射血分数(ejection fraction，EF%)和短轴缩短率(fractional shortening，FS%)。 1.2.5 心肌梗死面积的测定
在实验终点时，用2.5%的戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，剪开胸腔暴露心脏，排空心腔，分离主动脉逆行插管至主动脉瓣上，缓慢注入1%TTC染液3～5 mL，白色为梗死区，红色为非梗死区，－80 ℃快速冰冻，垂直于心脏长轴将心脏等厚度切6片，每片约2 mm，压片后浸于4%多聚甲醛中固定24 h[16]，随后照相并用Image J 软件计算心肌梗死面积[17](%，梗死面积/左心室面积×100%)。 1.2.6 Western blot 检测心肌组织中MG53蛋白的表达
提取总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。等量蛋白(100 μg)上样进行电泳分离(10% SDS-PAGE)，半干转印法转至硝酸纤维素膜(nitrocellulose blotting membranes，NC)上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗孵育MG53抗体(1 ∶500)，GAPDH抗体(1 ∶500)，4 ℃过夜。复温后TBST漂洗3次，15 min/次，加入1 ∶15 000 的荧光二抗，室温避光孵育1.5 h，TBST漂洗3次。用ODYSSEY红外凝胶扫描系统扫描条带，Quantity One 软件对MG53/GAPDH灰度值进行定量分析。 1.3 统计学分析
应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，数据以x±s表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，生存分析用Log-rank检验(Kaplan-Meier 法)。 2 结果 2.1 气道滴灌后大鼠肺组织HE染色
HE染色显示，气道滴灌PBS组肺组织结构未见明显异常，而PM2.5组肺组织结构紊乱，肺泡隔纤维组织增生，炎症细胞浸润，并可见肺组织内细颗粒物沉积(图 1)。
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| A：PBS组；B：PM2.5 组；↗：示PM2.5沉积处 图 1 各组大鼠气道滴灌后肺组织病理改变(HE ×400) |
如表 1所示，手术组中MI+PM2.5组与MI组相比，前者的EF%、FS%明显降低(P<0.05)，LVIDd和LVIDs较后者显著增大(P<0.05)，而Sham+PM2.5组与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)。上述结果说明PM2.5可以降低大鼠心功能，而MI大鼠在PM2.5干预后心功能降低更明显。
| 组别 | EF(%) | FS(%) | LVIDd(mm) | LVIDs(mm) |
| Sham组 | 74.60±1.51a | 36.88±1.25a | 6.50±0.56 a | 4.11±0.35a |
| Sham+PM2.5组 | 72.38±2.00a | 34.88±1.55a | 6.83±0.35 a | 4.41±0.25a |
| MI组 | 47.13±4.09 | 19.38±2.07 | 7.50±0.50 | 6.07±0.79 |
| MI+PM2.5组 | 37.14±5.14a | 14.57±2.44a | 8.20±0.78a | 7.01±0.68a |
| a：P<0.05，与MI组比较 | ||||
图 2所示为TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积，白色为梗死区域，红色为非梗死。如图 2所示，Sham组心脏切片无明显梗死区，而MI组可见明显梗死区。MI+PM2.5组心肌梗死面积[(17.78±2.13)%]较MI组[(11.49±2.23)%] 进一步增大(P<0.05)，提示有心肌梗死基础病理存在时，PM2.5会进一步加重心肌梗死。
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| 1：心尖；2：1/3处；3：1/2处；4：2/3处；5：5/6处；6：心底 图 2 TTC染色观察各组大鼠术后气道滴灌4周后心肌梗死面积变化 |
图 3是通过Log-rank检验分析各组生存状况，MI+ PM2.5组与其他组的生存率有统计学差异(P<0.05)，提示处于心梗状态并PM2.5环境中时生存率会明显下降。
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| a：P<0.05，与MI+PM2.5组比较 图 3 各组大鼠心梗(或假手术)术后气道滴灌PM2.5 4周的生存率变化 |
与Sham组(1.06±0.08)相比，Sham+PM2.5组(1.04±0.03)的心肌组织中MG53蛋白表达略微降低，但无统计学差异。而MI+PM2.5组(0.8±0.18)与MI组(1.02±0.10)相比，心肌梗死部位组织中MG53蛋白表达显著降低(P<0.05，图 4)，提示PM2.5可以明显降低心肌梗死组织中MG53蛋白的表达。
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| 1： Sham组； 2： Sham+PM2.5组； 3： MI组； 4： MI+PM2.5组 图 4 Western blot检测各组大鼠心肌梗死区组织中 MG53蛋白的表达 |
PM2.5随呼吸入肺后可引起氧化产物、炎性介质、血管活性分子的释放[18]，因其粒径小亦可直接进入血液循环系统发挥其毒性作用[19]，使人体发生动脉粥样硬化、血管功能障碍、急性心肌梗死等，但是PM2.5影响MI的程度及原因尚不完全清楚。
心肌细胞的凋亡坏死是心肌梗死的一个重要病理原因，而质膜完整性的破坏是细胞凋亡坏死的原因之一。对于膜修复已有众多的研究，MG53蛋白(亦称 TRIM72)是近几年研究的一个热点。MG53是由477个 氨基酸组成的心肌/骨骼肌特异性的TRIM家族成员，TRIM家族的蛋白参与细胞许多生命过程，如细胞凋亡、细胞周期等。当细胞膜受损，内源性MG53蛋白可与胞浆内的囊泡和肌纤维膜紧密结合，在胞外钙的介导下由胞浆向胞膜转移，参与细胞膜的修复[11, 12, 13, 14]。
流行病学资料[6, 7]显示，PM2.5会增加心肌梗死的发病率、死亡率。因此，我们设想PM2.5加重心肌梗死的程度可能与PM2.5下调MG53蛋白的表达从而影响膜修复有关。我们通过结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型[15]，气道滴灌PM2.5混悬液模拟吸入PM2.5，4周后观察了大鼠肺组织病理变化及心脏器质性和功能性的变化。实验结果示气道滴灌PM2.5组大鼠心肌梗死面积明显增加，心功能显著降低，表明有心肌梗死基础疾病存在时PM2.5会进一步加重心肌梗死的程度；而无心肌梗死基础疾病时PM2.5对心功能也有微弱的影响。同时本实验观察了PM2.5对心肌梗死生存率的影响。处于心梗状态并PM2.5环境中时生存率会明显下降。这与O’Donnell等[20]报道的颗粒物相关的缺血性中风的风险可能会增加相符。与假手术的2组相比，MG53蛋白的表达在2个手术组均降低，经气道滴灌PM2.5染毒处理后，MI+PM2.5组的MG53蛋白表达较MI组明显降低，表明PM2.5可明显降低创伤组的MG53蛋白的表达。
综上所述，我们从动物实验方面验证了PM2.5加重心肌梗死的程度，其原因可能与PM2.5抑制MG53蛋白的表达有关。因PM2.5成分复杂，加之PM2.5采样地点、季节的局限性使其成分含量有所差别，故而实验具有一定的局限性和机制的不确定性，而何种成分起了关键作用有待进一步研究。目前PM2.5影响心肌梗死的具体机制尚不完全明确，但我们相信随着科研与临床的更多探索，PM2.5如何调节MG53蛋白的表达从而加重心肌梗死的认识将会日渐清晰，并为进一步认识环境因素影响心血管疾病拓宽新的视角和研究思路。目前我们应积极制定更为有效的颗粒物污染控制措施，以降低患者发病率和死亡率，更好地保护易感人群。
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