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G蛋白偶联受体激酶4对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响
徐雪飞, 李美香, 任红梅, 韩 愈, 陈彩宇, 周 林, 曾春雨    
(400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科,重庆市心血管病研究所)
摘要:目的 研究G蛋白偶联受体激酶4(GRK4)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法 以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10细胞)为靶细胞,检测在不同浓度的ox-LDL (10、20、30、40、60、80 mg/L)刺激下A10细胞的增殖情况;观察ox-LDL(40 mg/L)刺激下A10细胞GRK4表达变化;用siRNA干扰A10细胞GRK4表达后,检测ox-LDL对A10细胞增殖的影响。Western blot 检测GRK4蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖活力。结果 用不同浓度ox-LDL刺激A10细胞,发现ox-LDL(40 mg/L)刺激下细胞增殖幅度可达78.3%(P<0.05),且细胞GRK4蛋白表达增加;与对照组相比,用siRNA干扰A10细胞GRK4表达后ox-LDL对A10细胞增殖的影响明显减弱。结论 ox-LDL可增强GRK4表达,干扰细胞GRK4表达后可减弱ox-LDL诱导的大鼠平滑肌细胞的增殖。
关键词: GRK4     ox-LDL     血管平滑肌细胞     增殖    
Application of stem cells in repair and reconstruction in lower urinary tract diseases
Xu Xuefei, Li Meixiang, Ren Hongmei, Han Yu, Chen Caiyu, Zhou Lin, Zeng Chunyu    
(Department of Cardiology, Chongqing Institute of Cardiovascular Diseases, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China)
Abstract:Objective To determine the effect of G protein-coupled receptor kinase 4 (GRK4) on the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL). Methods After the rat thoracic aortic smooth muscle cell line A10 was treated by ox-LDL at 10, 20, 30, 40, 60 and 80 mg/L respectively, the cell viability was detected by CKK-8 assay. Western blotting was used to observe the GRK4 expression in the A10 cells treated by 40 mg/L ox-LDL and in the A10 cells transfected with GRK4 siRNA followed by 40 mg/L ox-LDL treatment. The proliferation of A10 cells transfected with GRK4 siRNA and 40 mg/L ox-LDL treatment were also observed by CCK-8 assay. Results Ox-LDL of 40 mg/L increased the proliferation of A10 cells with a maximal proliferative amplitude of 78.3% (P<0.05) and enhanced the protein expression of GRK4 when compared with control group (0.367 9±0.049 1 vs 0.193 0±0.038 5, P<0.05). Compared with the control group (1.050 1±0.302 9), the proliferation of A10 cells treated with ox-LDL (1.929 1±0.390 0) was significantly decreased in GRK4 siRNA transfected cells (1.403 2±0.164 4, P<0.05). Conclusion Ox-LDL enhances GRK4 expression, and further improves the proliferation of smooth muscle cells.
metformin: G protein-coupled receptor kinase 4     oxidized low density lipoprotein     vascular smooth muscle cells     proliferation    

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大多数心脑血管疾病所共同含有的病理基础,其发病机制与血脂异常和血管壁成分改变密切相关。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)异常增殖在动脉粥样硬化的形成及发展过程中发挥重要作用,诸多因素均可导致VSMCs的增殖异常;氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是AS的独立危险因素之一[1],研究表明[1, 2]ox-LDL除了可介导泡沫细胞的形成、具有细胞毒性作用以外,还可作用于VSMCs,明显促进其增殖、迁移[3],参与动脉粥样硬化的发生、发展。有研究表明[4, 5],脂代谢紊乱与G蛋白偶联受体激酶家族(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)的相互影响与动脉粥样硬化发生、发展密切相关,GRK2、GRK5可参与脂代谢紊乱对动脉粥样硬化的影响过程,并在其中起重要作用。

G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled receptor kinase 4,GRK4)为丝氨酸/苏氨酸激酶,是GRKs中的一员,可通过影响多巴胺、血管紧张素Ⅱ受体等发挥对血压的调节作用[6]。在我们以往的研究中发现,GRK4除了在睾丸、肾脏、脑组织中表达外[7],还存在于VSMCs上[8]。但在ox-LDL的刺激下GRK4对于VSMCs增殖的作用以及ox-LDL对VSMCs中GRK4表达的影响尚缺乏研究。

本实验以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10细胞)为靶细胞,用ox-LDL刺激后观察A10细胞的增殖活力以及GRK4表达的变化,用siRNA干扰A10细胞GRK4表达后,检测ox-LDL对A10细胞增殖的影响,以期初步阐明GRK4与ox-LDL的相互影响以及GRK4在动脉粥样硬化发生、发展中的作用,旨在为动脉粥样硬化的预防及机制研究提供新思路和新靶点。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10)购自ATCC公司;DMEM高糖培养基、FBS胎牛血清购自美国Gibco公司;ox-LDL产品名称为L-α溶血卵磷脂(来源于鸡蛋黄),购自美国Sigma公司;CCK-8测定细胞增殖试剂盒购自碧云天公司;兔抗GRK4、兔抗GAPDH一抗购自美国Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;大鼠GRK4 siRNA及Scramble siRNA于广州锐博公司合成,GRK4 siRNA序列为5′-CCAAGAGAGUACAUACUAUdTdT-3′。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及处理

大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10),调整细胞密度为1×104,接种于25 cm2培养瓶中,以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基、37 ℃(5% CO2)细胞培养箱培养。细胞长至90%密度时以0.25%胰蛋白酶消化,吹打制悬,进行传代及铺板。 1.2.2 CCK-8检测A10细胞增殖活力

细胞吹打制悬后,调整细胞密度为2×103个/孔接种于96孔板,培养24 h后更换无血清DMEM高糖培养基饥饿2 h,每孔加入10 μL ox-LDL培养48 h。于检测前每孔加入10 μL CCK-8溶液,放回培养箱培养1 h后用酶标仪在450 nm波长下测定各孔光密度值[D(450)]。

分别观察在ox-LDL(10、20、30、40、60、80 mg/L)刺激下A10细胞的增殖活力;ox-LDL (40 mg/L)刺激下,siRNA干扰A10细胞GRK4表达后,A10细胞增殖活力的变化。 1.2.3 免疫印迹法检测GRK4表达

分离血管平滑肌组织及用ox-LDL(40 mg/L)干预A10细胞后,采用常规方法提取组织、细胞蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。以SDS-PAGE电泳分离蛋白质,半干转移法转移蛋白至NC膜,以5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST液漂洗,加入GRK4一抗(稀释浓度为1 ∶500),室温孵育1 h 后放入4 ℃孵育过夜,TBST液漂洗3次,加入羊抗兔IgG(稀释浓度为1 ∶15 000),室温孵育1 h,TBST液洗涤3次后以ODYSSEY-红外凝胶扫描系统扫描并定量各条带的总灰度值。 1.2.4 GRK4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达

细胞吹打制悬,接种于6孔板中,待其生长密度为50%~60%时更换无血清培养基,饥饿2 h后进行转染。步骤如下:①245 μL无血清DMEM中加入5 μL siRNA;②240 μL无血清DMEM中加入10 μL Lipofectamine 2000;③将①和②放于室温孵育5 min后混合形成转染液,室温静置15 min;④6孔板中每孔加入1.5 mL无血清培养基,并加入500 μL转染液,混合后置于37 ℃(5% CO2)细胞培养箱培养中转染,6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。 1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示,两组间比较采用两样本均数t检验,两组以上的比较采用单因素方差分析。 2 结果 2.1 ox-LDL对A10细胞增殖的影响

以不同浓度ox-LDL(10、20、30、40、60、80 mg/L)刺激A10细胞,CCK-8检测细胞增殖活力,发现ox-LDL 呈浓度依赖性促进A10细胞增殖,浓度为40 mg/L 时增殖幅度可达78.3%(P<0.05,n=7)。表明ox-LDL可促进A10细胞的增殖,40 mg/L为最佳浓度(图 1)。

a:P<0.05,与对照组比较 图 1 CCK-8检测不同浓度ox-LDL对A10细胞增殖的影响
2.2 ox-LDL(40 mg/L)刺激A10细胞GRK4的改变

采用ox-LDL(40 mg/L)刺激A10细胞,Western blot检测细胞GRK4表达变化,可看出在ox-LDL(40 mg/L)刺激下,与对照组相比,细胞GRK4蛋白表 达量增加[实验组(0.367 9±0.049 1),对照组(0.193 0± 0.038 5),P<0.05]。提示ox-LDL刺激A10细胞后,细胞GRK4表达增加(图 2)。

1:对照组;2:实验组 图 2 Western blot检测ox-LDL(40 mg/L)刺激A10细胞后GRK4表达的改变
2.3 GRK4 siRNA干扰A10细胞后细胞GRK4蛋白的表达改变

观察GRK4 siRNA(50 nmol/L)转染A10细胞后,细胞GRK4表达的抑制效应及程度。Scramble siRNA为乱序RNA,对细胞表达GRK4无影响,可作为对照组使用。采用Western blot检测GRK4蛋白表达变化。Western blot结果显示干扰后A10细胞GRK4蛋白表达降低[对照组(0.339 2±0.081 8),Scramble siRNA组(0.343 5±0.081 7),GRK4 siRNA组(0.189 7±0.030 7),干扰效率为44.8%],说明GRK4 siRNA能有效阻断A10细胞GRK4的表达(图 3)。

1:对照组;2:Scramble siRNA组;3:GRK4 siRNA组 图 3 Western blot检测GRK4 siRNA干扰A10细胞后的GRK4蛋白表达
2.4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达后细胞的增殖活力改变

siRNA干扰A10细胞的GRK4表达,以ox-LDL(40 mg/L)刺激,CCK-8检测细胞的增殖活力。显示在ox-LDL(40 mg/L)刺激下,干扰细胞GRK4表达后,A10细胞的增殖活力减弱[对照组(1.050 1±0.302 9),ox-LDL刺激组(1.929 1±0.390 0),siRNA组(1.403 2 ±0.164 4),P<0.05]。提示GRK4在ox-LDL所诱导的平滑肌细胞增殖中起重要作用。 3 讨论

AS是心血管疾病的病理基础,是心血管疾病发病及致死的重要原因,其发病机制目前尚未完全阐明,目前认为与血管内皮损伤、氧化应激、炎症浸润、平滑肌细胞增殖等密切相关。以往研究表明,VSMCs的增殖是AS产生及发展的病理学基础,在AS发生、发展中扮演重要角色[9, 10]。此外,研究证实血浆中ox-LDL水平与冠状动脉粥样硬化病变程度呈正相关[11],而ox-LDL除了化学趋化作用、加速泡沫细胞形成、细胞毒性作用等之外,还可通过促进VSMCs的表型转化、促进DNA合成、刺激血小板源性生长因子合成等影响血管平滑肌细胞的增殖[3, 12]

GRK可参与对G蛋白偶联受体的调控,在全身各个器官发挥重要作用。以往研究指出[4, 5],在脂代谢紊乱情况下,GRKs对AS的发生、发展有密切关系。其中的GRK5可影响NF-κB活性、平滑肌细胞血小板源性生长因子受体-β等,GRK2可调节白细胞的趋化作用,二者均可参与脂代谢紊乱对动脉粥样硬化的影响过程,并发挥重要作用。GRK4亦属于GRKs,以往研究多集中于GRK4影响肾脏多巴胺受体、血管紧张素Ⅱ受体等发挥对血压的调节作用[6]。我们以往研究中发现GRK4存在于血管平滑肌细胞上[8]。而存在于血管平滑肌细胞上的GRK4是否参与ox-LDL诱导的VSMCs增殖的影响尚缺乏研究。

文献[13, 14]报道,ox-LDL可激活MAPK通路,上调粘附因子、趋化因子、炎性因子等基因的表达进而影响VSMC的增殖,促进动脉粥样硬化斑块的形成;以往研究发现[15],GRK4可在病变组织中表达,GRK4的表达与ERK1/2介导的MAPK通路激活有关,即MAPK通路的激活可以刺激GRK4在组织中的表达。故我们假设ox-LDL可通过激活MAPK通路增加GRK4的表达,在细胞实验中,以ox-LDL刺激A10细胞,细胞增殖活力增加,且GRK4表达增加,验证了这一假设;我们进一步采用GRK4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达,检测ox-LDL对A10细胞增殖作用的影响,发现干扰GRK4表达之后细胞增殖作用明显减弱,该结果表明GRK4参与了ox-LDL所介导的VSMCs的增殖作用。

由此我们得出结论,GRK4可以参与ox-LDL诱导的VSMCs的增殖作用,抑制GRK4的表达后,ox-LDL所介导的VSMC的增殖作用减弱,该发现为动脉粥样硬化发生、发展的机制研究提供了新方向,为疾病的预防及治疗指出了新思路和新靶点。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408207
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

徐雪飞,李美香,任红梅,韩 愈,陈彩宇,周 林,曾春雨.
Xu Xuefei, Li Meixiang, Ren Hongmei, Han Yu, Chen Caiyu, Zhou Lin, Zeng Chunyu.
G蛋白偶联受体激酶4对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响
Application of stem cells in repair and reconstruction in lower urinary tract diseases
第三军医大学学报, 2015, 37(03): 248-251.
J Third Mil Med Univ, 2015, 37(03): 248-251.
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201408207

文章历史

收稿:2014-09-15
修回:2014-11-14

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