动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大多数心脑血管疾病所共同含有的病理基础,其发病机制与血脂异常和血管壁成分改变密切相关。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)异常增殖在动脉粥样硬化的形成及发展过程中发挥重要作用,诸多因素均可导致VSMCs的增殖异常;氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是AS的独立危险因素之一[1],研究表明[1, 2]ox-LDL除了可介导泡沫细胞的形成、具有细胞毒性作用以外,还可作用于VSMCs,明显促进其增殖、迁移[3],参与动脉粥样硬化的发生、发展。有研究表明[4, 5],脂代谢紊乱与G蛋白偶联受体激酶家族(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)的相互影响与动脉粥样硬化发生、发展密切相关,GRK2、GRK5可参与脂代谢紊乱对动脉粥样硬化的影响过程,并在其中起重要作用。
G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled receptor kinase 4,GRK4)为丝氨酸/苏氨酸激酶,是GRKs中的一员,可通过影响多巴胺、血管紧张素Ⅱ受体等发挥对血压的调节作用[6]。在我们以往的研究中发现,GRK4除了在睾丸、肾脏、脑组织中表达外[7],还存在于VSMCs上[8]。但在ox-LDL的刺激下GRK4对于VSMCs增殖的作用以及ox-LDL对VSMCs中GRK4表达的影响尚缺乏研究。
本实验以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10细胞)为靶细胞,用ox-LDL刺激后观察A10细胞的增殖活力以及GRK4表达的变化,用siRNA干扰A10细胞GRK4表达后,检测ox-LDL对A10细胞增殖的影响,以期初步阐明GRK4与ox-LDL的相互影响以及GRK4在动脉粥样硬化发生、发展中的作用,旨在为动脉粥样硬化的预防及机制研究提供新思路和新靶点。 1 材料与方法 1.1 主要试剂
大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10)购自ATCC公司;DMEM高糖培养基、FBS胎牛血清购自美国Gibco公司;ox-LDL产品名称为L-α溶血卵磷脂(来源于鸡蛋黄),购自美国Sigma公司;CCK-8测定细胞增殖试剂盒购自碧云天公司;兔抗GRK4、兔抗GAPDH一抗购自美国Santa Cruz公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;大鼠GRK4 siRNA及Scramble siRNA于广州锐博公司合成,GRK4 siRNA序列为5′-CCAAGAGAGUACAUACUAUdTdT-3′。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养及处理
大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10),调整细胞密度为1×104,接种于25 cm2培养瓶中,以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基、37 ℃(5% CO2)细胞培养箱培养。细胞长至90%密度时以0.25%胰蛋白酶消化,吹打制悬,进行传代及铺板。 1.2.2 CCK-8检测A10细胞增殖活力
细胞吹打制悬后,调整细胞密度为2×103个/孔接种于96孔板,培养24 h后更换无血清DMEM高糖培养基饥饿2 h,每孔加入10 μL ox-LDL培养48 h。于检测前每孔加入10 μL CCK-8溶液,放回培养箱培养1 h后用酶标仪在450 nm波长下测定各孔光密度值[D(450)]。
分别观察在ox-LDL(10、20、30、40、60、80 mg/L)刺激下A10细胞的增殖活力;ox-LDL (40 mg/L)刺激下,siRNA干扰A10细胞GRK4表达后,A10细胞增殖活力的变化。 1.2.3 免疫印迹法检测GRK4表达
分离血管平滑肌组织及用ox-LDL(40 mg/L)干预A10细胞后,采用常规方法提取组织、细胞蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。以SDS-PAGE电泳分离蛋白质,半干转移法转移蛋白至NC膜,以5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST液漂洗,加入GRK4一抗(稀释浓度为1 ∶500),室温孵育1 h 后放入4 ℃孵育过夜,TBST液漂洗3次,加入羊抗兔IgG(稀释浓度为1 ∶15 000),室温孵育1 h,TBST液洗涤3次后以ODYSSEY-红外凝胶扫描系统扫描并定量各条带的总灰度值。 1.2.4 GRK4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达
细胞吹打制悬,接种于6孔板中,待其生长密度为50%~60%时更换无血清培养基,饥饿2 h后进行转染。步骤如下:①245 μL无血清DMEM中加入5 μL siRNA;②240 μL无血清DMEM中加入10 μL Lipofectamine 2000;③将①和②放于室温孵育5 min后混合形成转染液,室温静置15 min;④6孔板中每孔加入1.5 mL无血清培养基,并加入500 μL转染液,混合后置于37 ℃(5% CO2)细胞培养箱培养中转染,6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。 1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示,两组间比较采用两样本均数t检验,两组以上的比较采用单因素方差分析。 2 结果 2.1 ox-LDL对A10细胞增殖的影响
以不同浓度ox-LDL(10、20、30、40、60、80 mg/L)刺激A10细胞,CCK-8检测细胞增殖活力,发现ox-LDL 呈浓度依赖性促进A10细胞增殖,浓度为40 mg/L 时增殖幅度可达78.3%(P<0.05,n=7)。表明ox-LDL可促进A10细胞的增殖,40 mg/L为最佳浓度(图 1)。
2.2 ox-LDL(40 mg/L)刺激A10细胞GRK4的改变采用ox-LDL(40 mg/L)刺激A10细胞,Western blot检测细胞GRK4表达变化,可看出在ox-LDL(40 mg/L)刺激下,与对照组相比,细胞GRK4蛋白表 达量增加[实验组(0.367 9±0.049 1),对照组(0.193 0± 0.038 5),P<0.05]。提示ox-LDL刺激A10细胞后,细胞GRK4表达增加(图 2)。
2.3 GRK4 siRNA干扰A10细胞后细胞GRK4蛋白的表达改变观察GRK4 siRNA(50 nmol/L)转染A10细胞后,细胞GRK4表达的抑制效应及程度。Scramble siRNA为乱序RNA,对细胞表达GRK4无影响,可作为对照组使用。采用Western blot检测GRK4蛋白表达变化。Western blot结果显示干扰后A10细胞GRK4蛋白表达降低[对照组(0.339 2±0.081 8),Scramble siRNA组(0.343 5±0.081 7),GRK4 siRNA组(0.189 7±0.030 7),干扰效率为44.8%],说明GRK4 siRNA能有效阻断A10细胞GRK4的表达(图 3)。
2.4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达后细胞的增殖活力改变siRNA干扰A10细胞的GRK4表达,以ox-LDL(40 mg/L)刺激,CCK-8检测细胞的增殖活力。显示在ox-LDL(40 mg/L)刺激下,干扰细胞GRK4表达后,A10细胞的增殖活力减弱[对照组(1.050 1±0.302 9),ox-LDL刺激组(1.929 1±0.390 0),siRNA组(1.403 2 ±0.164 4),P<0.05]。提示GRK4在ox-LDL所诱导的平滑肌细胞增殖中起重要作用。 3 讨论
AS是心血管疾病的病理基础,是心血管疾病发病及致死的重要原因,其发病机制目前尚未完全阐明,目前认为与血管内皮损伤、氧化应激、炎症浸润、平滑肌细胞增殖等密切相关。以往研究表明,VSMCs的增殖是AS产生及发展的病理学基础,在AS发生、发展中扮演重要角色[9, 10]。此外,研究证实血浆中ox-LDL水平与冠状动脉粥样硬化病变程度呈正相关[11],而ox-LDL除了化学趋化作用、加速泡沫细胞形成、细胞毒性作用等之外,还可通过促进VSMCs的表型转化、促进DNA合成、刺激血小板源性生长因子合成等影响血管平滑肌细胞的增殖[3, 12]。
GRK可参与对G蛋白偶联受体的调控,在全身各个器官发挥重要作用。以往研究指出[4, 5],在脂代谢紊乱情况下,GRKs对AS的发生、发展有密切关系。其中的GRK5可影响NF-κB活性、平滑肌细胞血小板源性生长因子受体-β等,GRK2可调节白细胞的趋化作用,二者均可参与脂代谢紊乱对动脉粥样硬化的影响过程,并发挥重要作用。GRK4亦属于GRKs,以往研究多集中于GRK4影响肾脏多巴胺受体、血管紧张素Ⅱ受体等发挥对血压的调节作用[6]。我们以往研究中发现GRK4存在于血管平滑肌细胞上[8]。而存在于血管平滑肌细胞上的GRK4是否参与ox-LDL诱导的VSMCs增殖的影响尚缺乏研究。
文献[13, 14]报道,ox-LDL可激活MAPK通路,上调粘附因子、趋化因子、炎性因子等基因的表达进而影响VSMC的增殖,促进动脉粥样硬化斑块的形成;以往研究发现[15],GRK4可在病变组织中表达,GRK4的表达与ERK1/2介导的MAPK通路激活有关,即MAPK通路的激活可以刺激GRK4在组织中的表达。故我们假设ox-LDL可通过激活MAPK通路增加GRK4的表达,在细胞实验中,以ox-LDL刺激A10细胞,细胞增殖活力增加,且GRK4表达增加,验证了这一假设;我们进一步采用GRK4 siRNA干扰A10细胞GRK4表达,检测ox-LDL对A10细胞增殖作用的影响,发现干扰GRK4表达之后细胞增殖作用明显减弱,该结果表明GRK4参与了ox-LDL所介导的VSMCs的增殖作用。
由此我们得出结论,GRK4可以参与ox-LDL诱导的VSMCs的增殖作用,抑制GRK4的表达后,ox-LDL所介导的VSMC的增殖作用减弱,该发现为动脉粥样硬化发生、发展的机制研究提供了新方向,为疾病的预防及治疗指出了新思路和新靶点。
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