经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)以微弱直流电流刺激大脑皮层，诱导神经元兴奋性可逆的改变^[1]。目前研究tDCS对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)疗效的实验只有数例。Ferrucci等^[2]研究用tDCS刺激AD患者的颞顶区，发现阳极tDCS可以提高患者词语识别记忆准确度，阴极tDCS起到了相反的作用，且tDCS对视觉注意力没有作用。Boggio等^[3]报道连续5 d的阳极tDCS可提高AD患者视觉识别能力，后效至少能维持4周。虽然tDCS对AD具有潜在的治疗作用，但tDCS对学习记忆功能的改善机制还尚不清楚，而且没有分析影响tDCS疗效的因素。影响tDCS疗效的因素诸多，包括刺激强度、刺激时间、刺激极性和刺激位置等，其中刺激强度对疗效的影响最大^[4]。本实验运用不同强度的重复阳极tDCS刺激AD大鼠模型的额叶区，通过观察分析大鼠学习记忆行为，以期证实重复tDCS可显著改善AD大鼠学习记忆行为。 1 材料与方法 1.1 动物、主要试剂及仪器

健康雌性SD大鼠36只，月龄4个月，体质量250~ 320 g，由第三军医大学实验动物中心提供，适应性饲养1周后开始实验。Aβ_1-40(No. SCP0037)，Sigma公司提供；经颅直流电刺激仪，由重庆大学提供。 1.2 方法 1.2.1 Aβ_1-40的孵育

将Aβ_1-40用无菌生理盐水稀释为2 μg/μL，37 ℃下孵育1周，形成聚集态后放入4 ℃冰箱中保存。 1.2.2 动物分组

将36只大鼠分为假手术组、AD组、20 μA刺激组、60 μA刺激组、100 μA刺激组、200 μA 刺激组，每组6只。 1.2.3 模型制备

采用双侧海马注射Aβ_1-40法制作AD模型^[5]。对AD组和刺激组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，进行头部固定和毛皮准备。根据《大鼠脑立体定位图谱》^[6]确定海马位置。左右海马注射点坐标：前囟后3.4 mm，中线左右各旁开2 mm，颅骨表面下3.5 mm。 5 μL Aβ_1-40在5 min内匀速注入海马注射点，留针5~10 min，按1.0 mm/min 速度缓慢拔针，缝合皮肤筋膜并消毒。假手术组海马注入等量生理盐水。 1.2.4 经颅直流电刺激

造模2周后，用牙科水泥将刺激电极固定于大鼠的右侧额叶区，矩形参考电极固定于胸腹部^[7]。刺激时需用生理盐水浸湿电极以保证其良好的导电性^[8]。电极安装后次日开始给予电刺激。对各刺激组大鼠给予重复的阳极tDCS，刺激强度分别为20、60、100、200 μA，单次刺激时间为20 min，每天1次，连续刺激4 d为1个疗程，连续2个疗程，疗程间隔2 d。假手术组和AD组则接受相同条件下的10 s的直流刺激(假刺激)。 1.2.5 行为学测试

tDCS结束后引入Morris水迷宫和Y迷宫测试大鼠的空间学习记忆能力。 1.2.5.1 Morris水迷宫^[9]

将水迷宫边缘等距离分为E、S、W、N 4个方向，迷宫被平分为4个象限。平台置于ES象限中央，低于水面1.0~2.0 cm。实验过程中保持周围环境安静，各参照物位置不变。

定向导航实验：实验前1 d，大鼠在迷宫中熟悉环境2 min(不放平台)。实验时，逐一将大鼠放入水中，记录大鼠在120 s内找到平台所需的时间，即潜伏期。若120 s内未找到平台，引导大鼠到平台上并停留10 s，潜伏期记为120 s；若120 s内找到平台，也让其在平台上停留10 s，以巩固记忆。每天训练大鼠4次，两次训练间隔15~20 min，连续训练4 d。

空间搜索实验：第5天，随机选一象限将大鼠放入水中(不放平台)，观察大鼠在120 s内的经过原平台的次数和原平台象限游泳时间。 1.2.5.2 Y迷宫

学习能力测试：采用不固定次数随机法测试大鼠学习记忆能力^[10]。将大鼠放入Y迷宫中适应5 min后再施加电刺激(设置刺激参数为：电压60 V，延时5 s)。训练时，随机变换安全区，规定大鼠受到电击后一次性逃往安全区为正确反应，并让其在安全区停留30 s，以巩固记忆。当大鼠连续10次训练中有9次正确反应(9/10)，则表示学习合格。记录大鼠达到9/10标准前所需的训练次数，以定量表征其学习合格时的成绩。

记忆能力测试：训练结束后24 h，按上述方法训练大鼠10次，记录正确反应次数作为记忆成绩，以表征记忆能力的高低。 1.2.6 病理形态学观察

待行为测试完成后，对各组大鼠脑组织进行灌注固定，制成25 μm厚冰冻切片，并行尼氏染色。 1.3 统计学处理

数据用x±s表示，应用SPSS 19.0分析处理。Morris 水迷宫中定向导航实验潜伏期采用重复测量单因素方差分析，空间搜索实验和Y迷宫数据采用单因素方差分析。若比较有统计学意义，则组间用Bonferroni进行post hoc比较。 2 结果 2.1 经颅直流电刺激后各组Morris水迷宫行为的比较 2.1.1 定位导航实验

与假手术组相比，AD组各时间点的潜伏期明显延长(P<0.05)，提示AD大鼠学习记忆能力减退。在60、100、200 μA的直流刺激后，大鼠的潜伏期与AD组相比得到大幅度的下降(P<0.05)。而20 μA的刺激虽然也能减小AD大鼠潜伏期，但与AD组相比却无统计学差异(P>0.05，表 1)。

虽然tDCS可增加AD大鼠经过原平台次数和原平台象限游泳时间，但增加作用均不显著(P>0.05，表 2)。

与假手术组相比，AD组达到9/10标准所需的训练 次数明显增加，记忆成绩明显下降(P<0.05)。100 μA组 和200 μA组的学习、记忆成绩较AD组均有明显改善(P<0.05)，20 μA和60 μA的电刺激对AD大鼠Y迷宫行为无显著影响(P>0.05，表 3)。

与假手术组相比，AD组大鼠海马CA1区神经元排列稀疏紊乱，尼氏体染色较浅，数量减少。而阳极tDCS后，大鼠海马CA1区神经元较AD组形态规则，胞质内尼氏体染色深，数量明显增加(图 1)。

A: 假手术组；B: AD组；C: 200 μA刺激组 图 1 重复经颅直流电刺激后各组大鼠海马CA1区尼氏染色观察

图选项

AD是一种进行性发展的神经退行性疾病。临床上多表现为记忆力和认知功能的减退，到AD中后期，甚至并发各种精神病症状(如失语、失认和抑郁等)和行为障碍^[11]。据统计，2006年总共2 660万人患有AD，随着社会的老龄化，AD患者数目在2050年预估会增长4倍^[3]。目前，可用的AD治疗方式不但价格昂贵，疗效不理想，甚至还会引入副作用。tDCS的出现无疑为AD的治疗提供了一种新的思路。研究结果一致表明tDCS具备改善AD患者认知能力的可能性，但并未分析影响tDCS疗效的因素，尤其是刺激强度对疗效的影响。

因此本实验对AD大鼠右侧额叶区重复施加不同强度的阳极tDCS，结果显示与假手术组相比，AD组大鼠在Morris迷宫和Y迷宫中出现明显学习记忆功能障碍，海马神经元尼氏体数量减少，着色变浅。100 μA 和200 μA的重复阳极tDCS可显著性提高大鼠Morris迷宫和Y迷宫学习记忆水平，尼氏体数目增加，染色加深。而20 μA和60 μA的tDCS对AD大鼠的作用不显著，表明tDCS疗效具有刺激强度依赖特点。当tDCS作用时，阳极和阴极之间微弱的直流电流在大脑内诱发静电场，在电势差的驱动下，神经元膜内外Na⁺和Ca²⁺发生迁移，从而起到调节神经元静息膜电位的作用^[12]。阳极tDCS通过膜电位的去极化以增加靶区域的兴奋性，阴极tDCS则超极化膜电位以抑制靶区域的兴奋^[13]。如果刺激电流过小，那么由于头皮和颅骨对电流的分流，电流不足以极化靶区域，引起兴奋性的改变。只有应用足够强的刺激电流(本实验为100 μA和200 μA)才可穿透障碍，以调节额叶皮层以及与学习记忆相关的神经回路的兴奋性。

不同于人体实验中安放电极的模式，本实验中选择非对称式安放电极：刺激电极固定于右侧额叶皮层，参考电极固定于胸腹部。这种电极安放模式有4个优点：①通过使用面积较小的刺激电极和面积较大的参考电极，可补偿tDCS较差的空间聚焦性^[14]。②相距较远的两个电极可减少电流在头皮和颅骨的分流，最大限度提高刺激位置下皮层的电流密度^[15]。③如果将参考电极放置在左侧额叶皮层，则刺激疗效可能是因为阳极tDCS诱发的右侧皮层兴奋性的增强，还需考虑因阴极tDCS对经胼胝体抑制的减弱作用而引起的右侧皮层兴奋性的增强。如此就无法单一分析阳极tDCS的影响。因此放置在胸腹部的参考电极，仅为了实现闭合的刺激回路，不会叠加对右侧皮层兴奋性的影响^[16]。④经测试，固定于头部的刺激电极十分的牢固，可防止刺激过程被大鼠打断。

我们选择额叶皮层作为刺激的靶位置，而不是常用的M1区。因为在Boggio等^[17]研究阳极tDCS对帕金森病患者的工作记忆能力的影响的实验中，发现用阳极tDCS刺激患者左前额叶皮层背外侧区(DLPFC)，工作记忆明显提升。而阳极刺激M1区和假刺激对工作记忆都没有产生明显的改变。其研究表明在改进工作记忆方面，刺激DLPFC区比刺激M1区所得到的效果更明显。

一般认为tDCS的安全性取决于刺激电流密度(电流强度/电极面积)。 Liebetanz等^[15]发现：将500 μA电流(电流密度为142.9 A/m²)作用于大鼠M1区不 到10 min，便可观察到明显的脑组织损伤，故规定动物实验中使用tDCS的电流密度安全阈值为142.9 A/m²。本实验中最大tDCS电流密度为63.69 A/m²(200 μA/3.14 mm²)，没有超过安全阈值。

本研究结果证实重复阳极tDCS可显著性改善AD大鼠学习记忆功能障碍，旨在为tDCS在AD临床中的应用提供必要的支持。但是本研究也存在一些不足：没有检测重复tDCS后效的持续情况，没有检测阴极tDCS对AD的作用，tDCS与运动训练以及药物治疗相结合是否能产生更显著的疗效等，在后续实验中有必要对上述问题进行探讨。